Hoechst33258，也称bisBenzimideH33258或HOE33258。分子式为C25H24N6O3HCl，分子量为533.88，CASNumber23491-45-4。
Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst33258为特异性DNA染料，与A-T键结合，这种染料对死细胞或经70%冷乙醇固定的细胞可立即染色。而活细胞的着色是渐进性的，在10min内可达饱和。在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
Hoechst33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。
【试剂与器材】
1.Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg，用20ml蒸馏水溶解后，滤过，4℃避光保存。用时蒸馏水10倍稀释成染色液。工作浓度为5mg/L。（用于细胞核染色时，推荐的Hoechst33258工作浓度为0.5-10微克/毫升）
2.封片液（pH5.5）：20mmol/L柠檬酸；50mmol/L磷酸氢二钠；50%甘油，长春新碱
3.细胞固定液甲醇、冰乙醇（3∶1），现配；70%冷乙醇；4%多聚甲醛。
【操作步骤】
1.贴壁细胞，让细胞自己在盖玻片上爬片。操作如下：
C.去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
D.加入0.5mlHoechst33258染色液(5mg/L)，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。
E.用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
F.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。
注：室温下晾干,在荧光(检测波长360nm,参比波长450nm)显微镜下观察,并随机拍照。
G.荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。
Hoechst33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱
2.悬浮细胞
B.离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。
C.最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
D.稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
E.均匀滴上0.5mlHoechst33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。
F.用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
G.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
H.荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。
3.组织切片
A.常规包埋切片后，脱腊，透明。
B.PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。
C.加入0.5mlHoechst33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。
D.用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
E.将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
F.荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。
如果荧光显微镜是倒置的，就不用爬片，可以直接固定，染色，观察。
不是倒置的无法直接看，爬片后，倒盖在波片上，显微镜才可以看。主要是看显微镜的类型问题。
【贮存条件】
放在棕色瓶中4°C储存最多可达6个月。-20℃避光保存，一年有效。
荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。
注意：Hoechst33258可能致癌或突变。戴手套和面罩，在通风厨中使用。
设阴性对照组，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml剂量组，6孔板（1×105/孔）细胞贴壁后加药培养48小时，离心弃上清，加入PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10min,PBS洗2次,用Hoechst33258(5mg/L)染色5min,再用PBS洗2次,室温下晾干,在荧光(检测波长360nm,参比波长450nm)显微镜下观察,并随机拍照。
Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。