本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物乳杆菌及其在制备食品中的应用。
背景技术：
当每周排便次数低于3次的时候会被视为处于便秘状态，当次数低于1次视为严重的便秘状态，是一种威胁人体健康，特别是对结肠健康具有较大影响的复杂症状。便秘通常不被视为疾病，大多数情况可以通过日常饮食和习惯的调节预防便秘。
技术实现要素：
本发明的目的在于对牦牛酸乳中的微生物进行分离鉴定，并对其活性和应用进行研究。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.植物乳杆菌ys4(lactobacillusplantarumys4)，保藏编号为cctccno：m2016750。
2.植物乳杆菌ys4在制备预防便秘的食品中的应用。
本发明对青海玉树藏族自治州的牦牛酸乳中的微生物进行了分离鉴定，将其中一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)命名为ys4，于2016年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2016750。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种植物乳杆菌ys4，其可以有效的抑制便秘，且效果显著优于常用的保加利亚乳杆菌，能够用于制备预防便秘的食品，不仅扩大了植物乳杆菌ys4的应用范围，提高了其应用价值，而且给便秘的预防带来了新的希望。
附图说明
图1为植物乳杆菌ys4的基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为λdna/hindiiimarker，1为植物乳杆菌ys4的基因组dna。
图2为植物乳杆菌ys4的16srdna基因片段的pcr扩增结果，其中m为dnamarker，c为阴性对照，1为植物乳杆菌ys4的16srdna基因片段的pcr扩增产物。
图3为植物乳杆菌ys4对活性炭诱导便秘小鼠体重的影响。
图5为植物乳杆菌ys4对活性炭诱导便秘小鼠小肠组织中c-kit和scfmrna表达的影响。
图6为植物乳杆菌ys4对活性炭诱导便秘小鼠小肠组织中trpv1、gdnf和nosmrna表达的影响。
图3至图6中，lb表示保加利亚乳杆菌，lp-ys4表示植物乳杆菌ys4。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、植物乳杆菌ys4的分离和鉴定
一、乳酸菌的分离纯化
采集青海玉树藏族自治州牧民家庭的自然发酵牦牛酸乳样品10份，每份样品用无菌玻棒充分搅匀后，吸取50ml放入无菌离心管中，置于食品采样箱内带回实验室，4℃冰箱保存。
每份牦牛酸乳样品取1ml，用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释至10-7。取10-5、10-6、10-7三个稀释度各1ml稀释液分别于装有15mlmrs培养基(含质量比为5％的caco3)的平皿中，混匀，置30℃恒温箱培养72±3h。每个稀释度作三个平行。菌落形成后，观察其形态特征，挑取有溶钙圈的不同菌落分别接种于脱脂乳培养基中，置30℃培养24～48h，待菌株生长良好后，划线接种于mrs琼脂培养基，置30℃培养48h；重复以上步骤至少三次，直至得到纯菌落。
将纯菌株在mrs固体培养基上划线，置30℃培养48h，用10倍放大镜观察菌落大小、形状等表观特征，进行革兰氏染色，挑取形态典型的菌株进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的球菌菌株和杆菌菌株，暂定为乳酸菌。
二、乳酸杆菌的鉴定
将初步筛选出的乳酸杆菌菌株分别进行生长温度试验(10℃、15℃、45℃、60℃，30min)、ph值梯度试验、运动性试验、接触酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、明胶液化实验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、葡萄糖产气试验、联苯胺试验、石蕊牛乳试验、精氨酸产氨试验、酪素分解试验以及各种糖醇发酵试验。
结果从10份牦牛酸乳样品中共分离纯化出20株乳酸杆菌，均为革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性。通过形态学观察和生理生化试验，将这20株菌株初步鉴定为7种乳酸杆菌，依次编号为lb1～lb7，其中，编号为lb7的乳酸杆菌初步鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)(表1)。
表1编号为lb7的乳酸杆菌的形态学特征和生理生化试验结果
注：+，阳性；－，阴性；+w，弱阳性。
三、植物乳杆菌的鉴定
因此，编号为lb7的乳酸杆菌鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，将其命名为ys4，并于2016年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2016750。
实施例2、植物乳杆菌ys4对活性炭诱导小鼠便秘的预防作用
本实施例使用的主要材料、仪器与实验动物如下：植物乳杆菌ys4(保藏号：cctccno：m2016750)，保加利亚乳杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心)；mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip(北京普尔伟业生物科技有限公司)；trizol试剂、oligodt18、rnase、dntp、mlv逆转录酶(美国invitrogen公司)；roxreferencedye和sybrpremixextaqii(日本takara公司)；rt-pcr引物(北京天根生化科技有限公司)。d550数码相机(日本佳能公司)；seveneasyph计(瑞士梅特勒-托利多公司)；imark酶标仪、t100梯度pcr仪(美国伯乐公司)。七周龄雌性昆明小鼠购自重庆医科大学实验动物中心(许可证号：syxk(渝)2012-0001)，饲养于控温控湿环境中(温度25±2℃，相对湿度50±5％)，每12h调节光/暗周期，提供小鼠标准饲料和饮水。
一、植物乳杆菌ys4抗胃酸能力和胆盐耐受力检测
乳酸菌要发挥益生菌作用，需要在胃和肠道的强酸性条件下，到达目的地(通常是大肠)定植并发挥其生理功效。因此，为了研究乳酸菌的潜在益生菌作用，建立体外虚拟模型，检测乳酸菌的抗胃酸能力和胆盐耐受力是重要的检测手段。
将nacl和胃蛋白酶溶于蒸馏水中并用1mol/l的hcl调整ph为3.0，达到nacl的质量比为0.2％，胃蛋白酶的质量比为0.35％，真空过滤去除细菌，作为人工胃液备用。将植物乳杆菌ys4活化后进行培养，取培养液5ml，3000r/min离心10min，收集菌体，用5ml生理盐水重悬后，与人工胃液按体积比1∶9混匀，37℃培养3h，测定0h和3h时的植物乳杆菌ys4活菌数，按公式计算植物乳杆菌ys4在ph3.0人工胃液中的生存率(％)＝3h活菌数(cfu/ml)/0h活菌数(cfu/ml)×100。
将植物乳杆菌ys4按2％的接种量接种于含有质量比为0.0、0.3％、0.5％、1.0％的牛胆盐的mrs-thio培养基，37℃培养24h，以未接种植物乳杆菌ys4的空白培养基为对照，在600nm处测定吸光度值，按公式计算植物乳杆菌ys4在胆盐中的生存率(％)＝含胆盐培养基od600/空白培养基od600×100。
结果如表2所示，植物乳杆菌ys4在ph3.0人工胃液中和不同浓度胆盐中的生存率均高于保加利亚乳杆菌，且植物乳杆菌ys4在ph3.0人工胃液中的生存率是保加利亚乳杆菌的约2.9倍，而在不同浓度胆盐中的生存率是保加利亚乳杆菌的约9-13倍，说明植物乳杆菌ys4具有比保加利亚乳杆菌更强的抗胃酸能力和胆盐耐受力。
表2植物乳杆菌ys4抗胃酸能力和胆盐耐受力检测
二、植物乳杆菌ys4对活性炭诱导小鼠便秘的预防作用
选取体重约25g的昆明小鼠100只，平均分为5组，分别是正常组、便秘对照组、保加利亚乳杆菌处理组、植物乳杆菌ys4低浓度处理组和高浓度处理组。适应饲养1周后，正常组和便秘对照组小鼠正常自由摄入饮食和饮水2周；在这2周中除了正常自由摄入饮食和饮水外，保加利亚乳杆菌处理组小鼠每日每只灌胃2ml的1.0×109cfu/ml的保加利亚乳杆菌，植物乳杆菌ys4低浓度处理组和高浓度处理组小鼠每日每只分别灌胃2ml的1×108cfu/ml的植物乳杆菌ys4和1×109cfu/ml的植物乳杆菌ys4。2周后除正常组小鼠外，其他4组小鼠每日灌胃2ml的活性炭水(温度为4℃，按质量比将10％的活性炭加入含10％阿拉伯树胶的水溶液中制成悬液)，同时乳酸菌处理各组继续灌胃乳酸菌，持续3天。
1、植物乳杆菌ys4对小鼠体重和粪便的影响
实验过程中每日上午定时测定所有小鼠的体重、膳食摄入量、饮水量、粪便重量和粪便湿度。
体重变化是小鼠发生便秘的重要指标。由图3可以看出，前2周中各组小鼠的体重都呈现出正常的增长状态，各组之间没有明显差异；活性炭诱导便秘后，没有经过活性炭处理的正常组小鼠体重继续增长，其余各组小鼠体重均出现下降，其中便秘对照组小鼠的体重下降最多，植物乳杆菌ys4高浓度处理组小鼠的体重最接近正常组，显著高于同浓度的保加利亚乳杆菌处理组，说明植物乳杆菌ys4能够抑制便秘造成的小鼠体重下降，且效果优于保加利亚乳杆菌。
排便状态可以最明显的体现便秘的程度，便秘状态中粪便重量、颗粒数和含水量均是重要的粪便状态指标，这些指数下降表现出便秘程度的加重。如表3所示，第1-14天各组小鼠的粪便重量、颗粒数和含水量没有显著差异；活性炭诱导便秘后，第15-17天正常组小鼠的粪便重量、颗粒数和含水量最高，便秘对照组最低，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以显著缓解便秘造成的粪便重量、颗粒数和含水量下降(p＜0.05)，但植物乳杆菌ys4高浓度处理组小鼠的粪便重量、颗粒数和含水量最接近正常组，显著高于同浓度的保加利亚乳杆菌处理组，说明植物乳杆菌ys4能够抑制便秘造成的小鼠粪便重量、颗粒数和含水量下降，且效果优于保加利亚乳杆菌。
表3植物乳杆菌ys4对小鼠粪便的影响
注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。
表4植物乳杆菌ys4对便秘小鼠胃肠道推进的影响
3、植物乳杆菌ys4对小鼠血清mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平的影响
取收集的小鼠血浆，4500rmp离心15min，分离血清，按试剂盒操作说明测定小鼠血清的mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平。mtl可以刺激胃蛋白酶的产生和促进肠道运动；gas能促进胃肠分泌和胃肠运动，促进幽门松弛，起到缓解便秘的作用；et在血管张力稳定性和维持基本心血管系统中起重要作用；ss可以刺激肠道运动；ache可以调节肌肉收缩和粘液分泌，可以使肌肉放松从而推进粪便排出；sp是一种有助于肠道蠕动的物质；保持vip在肠壁中的正常含量也是稳定肠道功能的重要手段。
由表5可以看出，正常组小鼠血清的mtl、gas、et、ache、sp和vip水平最高，ss水平最低；便秘对照组小鼠呈现出相反的趋势；保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以使上述物质的血清水平接近正常组水平，但植物乳杆菌ys4的作用更显著，说明植物乳杆菌ys4可以使便秘小鼠的血清mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平尽量保持正常，从而缓解便秘。
表5植物乳杆菌ys4对小鼠血清mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平的影响
4、植物乳杆菌ys4对小鼠小肠组织mrna表达的影响
取小鼠的小肠组织，粉碎后用rnazol提取结肠组织总rna，稀释至1μg/μl；取2μl稀释后的总rna提取液，依次加入1μl的oligodt18、rnase、dntp、mlv酶和10μl的5×buffer，37℃120min、99℃4min、4℃3min合成cdna；然后采用表6所述引物，rt-pcr扩增c-kit、scf、trpv1、gdnf和nos的mrna表达，以持家基因gapdh作为内参照；最后用含质量比为1％的溴化乙锭的琼脂电泳检查pcr扩增产物。
表6rt-pcr引物序列
便秘患者肠道内的icc(cajal间质细胞)较少，c-kit是icc的特异性标志物，是icc增殖的关键。scf浓度对icc的增殖非常重要，scf不存在的环境下icc不能进行生长。文献报道，便秘小鼠结肠组织中的icc含量较少，结肠组织中的c-kit表达水平也下降。植物乳杆菌ys4对小鼠小肠组织c-kit和scfmrna表达的影响见图5，便秘对照组小鼠小肠中c-kit和scfmrna表达下降，植物乳杆菌ys4可以显著上调小鼠小肠中的c-kit和scfmrna表达，且高浓度时作用更加明显。
trpv1已经被证实与排便有密切关系，激活trpv1可以触发神经递质的释放，从而导致小肠运动障碍。trpv1表达增加是肠损伤的一个显著现象，由于肠胃紊乱造成肠道损伤，使便秘患者有更高的trpv1表达。gdnf可以调节神经节细胞的功能，从而有助于修复受损的肠道，可防止便秘。nos对调节胃肠运动起重要作用。no的增加能造成更严重的结肠动力障碍，控制nos可以降低no的含量，是控制便秘的可行途径。植物乳杆菌ys4对小鼠小肠组织中trpv1、gdnf和nosmrna表达的影响见图6，正常组小鼠具有最高的gdnfmrna表达和最低的trpv1、nosmrna表达，而便秘对照组小鼠的gdnfmrna表达最低、trpv1和nosmrna表达最高，相对于便秘对照组，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以上调gdnfmrna表达和下调trpv1、nosmrna表达，但植物乳杆菌ys4的作用明显优于保加利亚乳杆菌。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110>重庆第二师范学院
<120>植物乳杆菌ys4及其在制备预防便秘的食品中的应用
<160>15
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物27f
<400>1
agagtttgatcctggctcag20
<210>2
<211>19
<223>引物1492r
<400>2
ggctaccttgttacgactt19
<210>3
<211>1469
<213>植物乳杆菌ys4（lactobacillusplantarumys4）
<223>16srdna基因片段
<400>3
catgatttacatttgagggagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccaga60
agcggggaataacacctggaaacagatgctataccgcataacaacttggaccgcatggtc120
cgagnttgaaagatggcttcggctatcagtgcaatggcggcttttggatggtcccgcggc180
gtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgaga240
gggtaatcggccacattgggactgactcacggccaaactcctacgggaggcagcagtagg300
gaatcttccacaatggacgaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaaaagggtttcg360
gctcgtaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgcagaaagccacggc420
taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgg480
gcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaa540
gaagtgcatcggaaatgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccattgtagc600
ggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcgctgtctggtctgtaac660
tgacgctgaggctcgaaagtatggtagcaaacaggattagataccctggtatccataccg720
taaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcatt780
aagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattacgggggccc840
gcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtctt900
gacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggt960
gcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttagtcccgcacgagcgcaaccc1020
ttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaacgga1080
ggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgcta1140
caatggatggtacaacagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattct1200
cagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatccggat1260
cagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgacacaccgcccgtcacaccatgagag1320
tttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaagggggacag1380
atgattagggtgggtcttgcctaatacatgcaagtcgaacgaactctggattgattggtg1440