基因突变范文

导语：如何才能写好一篇基因突变，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期。

不知为什么，我总觉得他有用不完的活力。整天嘻嘻哈哈的，给人以不务正业的感觉，就拿早上交作业这种芝麻绿豆大的小事来说他吧！

一大早，我都还没到学校，他就已经早早地坐在位子上了。一般来说只要一到学校就应该先把所有作业本交掉，可是这位大少爷从来没有过渌匕炎饕到蝗苁且乙欢僭俣么咚趴习炎饕到怀隼础S惺钡攘怂习胩欤詈缶谷幻蛔觯馈媸且凰帽芰恕U娴姑刮揖固狭苏饷匆桓鲎樵保。。。。

更气人的是在上一次的美术课上，老师要求我们画一幅可以突出别人外表特点的画，而且要画同班同学呢！可恶的可恨的陈甲森，他最喜欢笑话人了。在别人画完后，他就开始了他的“点评”有说别人画的像猪的，猴子的……还笑别人的画有多么难看。真是有多可恶就有多可恶！我就没看到他画的画有多么好看。我原本也想奚落一下他的画的，可是还没说出口，他就先说：“其实画缪艺是最简单的了，只要用圆规画就可以了。”然后哈哈大笑起来。我知道他是什么意思，不就说我的脸很圆很胖嘛！等等，他的意思是说我的脸很圆很胖。呀！这个该死的陈甲森，如果杀人不犯法的话，他恐怕已经被我杀个几千次了。

【关键词】基因突变染色体变异

[Abstract]Thisessaydiscussesthedifferencesinthechromosomeformationthecauseandtheresultsbetweengenemutationandchromosomestructurevariation

[Keywords]Genemutationchromosomevariation

我们在学习生物变异一节时，学到了基因突变和染色体结构变异，很多学生在做具体题时二者总是混，分不清。现将二者的区别简单加以介绍。

基因突变和染色体结构变异均是可遗传的变异，在遗传中表现出子代性状与亲代性状不同，出现亲代、祖代从来没有过的新性状，且这种性状能在后代中重新出现，可见是遗传物质发生变化了。两者区别表现在：

1染色体形态

1.1、基因突变是单个基因内部发生变化，从而引起该基因所控制的性状产生不同于亲代的变化。在光学显微镜下也看不到染色体形态的变化。

1.2、染色体结构变异是某个染色体在结构上发生变化，在光学显微镜下可以观察到染色体形态的改变。

2产生的原因

2.2、染色体结构变异是由于外界因素作用，染色体发生断裂和重新组合而造成染色体结构变化，改变遗传信息，我们课本提到了结构变异的四种情况（缺失、易位、倒位、重复）猫叫综合症是人体第五号染色体短辟上的缺失引起的疾病。

3结果不同

3.1、基因突变是不定向的，结果产生等位基因，如基因A可突变a，也可以突变为a1、a2、a3、……,a也可以突变成A。即同一性状在不同生物个体中发生突变后有不同的表现。例如，刮大风海岛上有翅昆虫可突变长翅和残翅昆虫。

3.2、染色体相同的结构变异后表现出的生物性状在不同生物个体均相同。如猫叫综合症，患儿都表现两眼距离较宽，反应迟钝，往往过早夭折，哭声似猫叫。

[关键词]非小细胞肺癌；KRAS基因突变；抑制KRAS下游效应分子；靶向治疗

ProgressintargetedtherapyofKRASmutationsinnon-smallcelllungcancer

ZHANGYukunGEWei

TheTwoDepartmentofOncology，RenminHospitalofWuhanUniversity，HubeiProvince，Wuhan430060，China

[Abstract]Lungcancerisoneofthemostdeadlymalignancies，rankingthefirstinglobalcancer-relateddeath.Withthedevelopmentofmultidisciplinarycomprehensivetreatment，themortalityrateofpatientswithlungcancerisstillhigh.KRASgenemutationsarethemostcommontypeofmutationsinnon-smallcelllung.Atpresent，thetargetedtherapyofKRASgenemutationmainlythroughthedirectinhibitionofKRASgene，changetheKRASmembranelocalization，inhibitionofKRASdownstreameffectormolecules，inhibitionofKRASmutantsynergisticlethalgenesandotheraspectsofresearch.Inthisreview，thestatusandprogressofKRASmutationsinnon-smallcelllungcancertargetedtherapyarebrieflyreviewed.

[Keywords]Non-smallcelllungcancer；KRASgenemutation；InhibitionofKRASdownstreameffectormolecule；Targetingtherapy

肺癌居世界范围内恶性肿瘤死因的第一位，每年有超过100万人因肺癌死亡[1]。其中非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的组织学类型，占所有肺癌的85%[2]。超过40%的患者确诊时已是局部晚期或晚期，失去了手术机会。目前肺癌的治疗逐渐多元化，包括手术、放化疗、靶向治疗、生物免疫治疗等，对于晚期NSCLC的一线化疗方案是以铂类为基础的两药联合，但其疗效已经达到治疗平台，随着医学分子生物学的飞速发展，分子靶向治疗为NSCLC患者带来了新的希望。靶向表皮生长因子受体（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）已广泛应用于NSCLC的治疗中。然而，10%～30%KRAS突变型肺癌患者无法从EGFR抑制剂中获益。此外，尽管早已确定了NSCLC中存在KRAS突变，但这仍然是一个具有挑战性的靶向治疗目标。

1治疗方法

1.1直接抑制KRAS基因

直接抑制KRAS基因已经被证明在临床上是有困难的。但也有学者通过抑制KRASG12C和GTP结合，促进其与GDP的结合，及抑制KRAS和其下游效应分子Braf结合来抑制KRAS基因的活性，如，Ostrem等[3]发现了一个KRASG12C突变体特异性抑制剂，该抑制剂能有效抑制KRASG12C突变体和GTP结合，促进其与GDP的结合，使突变KRAS基因失活。Lim等[4]报道了另一个KRASG12C抑制剂，在不影响正常KRAS的情r下特异性结合突变的KRAS基因，使突变的KRAS失去活性。

1.2改变KRAS膜定位

抑制KRAS膜定位，包括多种酶，如法尼基蛋白转移酶抑制剂（FTIs）、香叶基转移酶、RAS转换酶1（RCE1）、ICMT。第1代FTIs如Tipifarnib和Lonafarnib，虽然耐受性良好，但表现出较差的临床效应。尽管缺乏有效性认为是由于香叶基转移酶对KRAS基因选择性异戊烯化，但FTIs和香叶基转移酶的双重抑制也没有任何效果[5]。第2代FTIs如Salirasib[6]，在临床上对肺癌患者无效。这种无效性可能通过香叶基转移酶对KRAS基因选择性异戊烯化或选择性耐药机制来解释，如KRAS基因扩增或脱靶效应[7]。此外，一些RCE1和ICMT抑制剂，已在小鼠模型中有了可喜的成果，但是这些药物还需进一步优化才能进行人体试验。

1.3抑制KRAS下游效应分子

1.3.1PI3KPI3K是KRAS下游的一种胞质分子，也是PI3K/AKT/mTOR通路的一部分，它是一个多途径融合的位点。在NSCLC中发现约2%的PI3KCA突变。PI3K通路也可以通过PTEN的缺失、上游酪氨酸激酶受体扩增或KRAS基因突变被上调[8]。新型PI3K抑制剂（例如BKM120、GDC0941和XL147）在第一阶段临床试验中开发并初步显示出有希望的结果。这些药物目前正用于PI3KCA突变的晚期NSCLC患者进行的Ⅱ期临床试验（NCT01297491、NCT01493843）中。然而，尽管KRAS基因活性依赖于下游PI3K活性，但初步数据表明，KRAS突变的肿瘤对PI3K抑制剂单药治疗是不敏感的[9]。因此，单独抑制PI3K通路治疗KRAS突变的NSCLC是不足的，可尝试给予多个KRAS下游信号通路的抑制剂联合治疗。

1.3.2BRAFBRAF是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可直接作用于结合GTP的KRAS基因及激活BRAF/MEK/ERK/MAPK途径。BRAF基因突变在NSCLC中占1%～4%，其中50%的突变为V600E[10]。BRAF抑制剂达拉菲尼（Dabrafenib）和危罗菲尼（Vemurafenib），首先在BRAFV600E突变的黑色素瘤中做了研究，而且黑色素瘤V600E突变占BRAF突的百分比超过80%[11-12]，研究证明V600EBRAF突变的晚期NSCLC中，Dabrafenib估计反应率为40%[13]。一开放标签，多中心Ⅱ期临床试验中（NCT01336634），Dabrafenib加曲美替尼（Trametinib）治疗BRAF突变（V600E）的NSCLC可达到50%总反应率，且中位无进展生存期>9个月。Dabrafenib加Trametinib治疗BRAF突变（V600E）的NSCLC是很有前途的新疗法，可获得较高的总疗效，更可观的是延长了DOR[14]。

1.3.3mTOR在PI3K/AKT/mTOR中，mTOR是另外一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也是PI3K家族的成员。临床前数据表明，在KRAS基因突变的肺腺癌小鼠模型中，抑制mTOR基因可抑制肿瘤的生长[15]。一些mTOR抑制剂（例如依维莫司、Ridaforolimus）已在NSCLC的治疗研究获得了有前景的结果。一个Ⅱ期临床试验，70例患者KRAS突变的NSCLC患者接受Ridaforolimus治疗8周，在8周后，28例患者病情是稳定的，随后被随机分配接受安慰剂或继续维持Ridaforolimus治疗。最终，接受Ridaforolimus治疗的PFS是明显高于安慰剂组（4个月和2个月，HR=0.36，P=0.013），而且其OS有一个更好的趋势（18个月和5个月，HR=0.46，P=0.009）[16]。但是Ridaforolimus治疗的临床推广，仍需要更大型的Ⅲ期临床实验来进一步验证其在改善PFS、OS上的作用。

KRAS基因可以激活PI3K/AKT/mTOR和BRAF/MEK/ERK通路，因此抑制这两条信号通路可能需要完全阻断KRAS基因，有一些前期临床实验尝试了PI3K抑制剂或MEK抑制剂联合mTOR抑制剂治疗NSCLC，患者有较好的耐受性，但这些结果需要行Ⅱ期临床实验来进一步论证，但也给治疗NSCLC带来了新思路。

1.4抑制KRAS突变协同致死基因

KRAS突变可使癌细胞获得特殊的生物学行为，即其生长和存活依赖于其他协同基因的共同作用，因而抑制这些基因能杀死KRAS突变的癌细胞，所以抑制这些协同致死基因是杀死肿瘤细胞的一个间接、有效的策略。这些因子有很多，包括WT1、GATA2或参与NF-κB通路的小分子，并对这些因子作为靶点及特异性抑制剂做了一些临床前期研究。Vicent等[21]分析了大量样本，发现WT1基因高表达可能参与KRAS突变的致瘤作用。Kumar等[22]发现GATA-2是这些KRAS突变NSCLC肿瘤细胞存活所必要的基因。硼替佐米是NF-κB的蛋白酶体抑制剂，目前主要用于多发性骨髓瘤的治疗。在对16例KRASG12D突变的肺腺癌进行的Ⅱ期研究中发现，患者的中位生存期达到了13个月[23]。

此外，Puyol等[24]在NSCLC的小鼠肿瘤模型中，发现KRAS基因和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）有合成致死效应。Mao等[25]利用KRAS与CDK4基因之间的合成致死效应，使用携载有针对CDK4siRNA（siCDK4）的混合胶束颗粒对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示，携载有siCDK4的KRAS突变的肿瘤生长有显著抑制效果，KRAS野生型的肿瘤生长则没有受到显著影响，证实该治疗方案的特异性、高效性和安全性，为进一步开发针对KRAS突变的siRNA药物提供了新策略。

1.5其他

MET是一跨膜酪氨酸激酶受体，主要在肿瘤侵袭、增殖、血管生成和转移中发挥重要作用，也可以参与激活KRAS信号通路。在肺腺癌中MET扩增约4%，通过激活RAS/PI3K/AKT/mTOR通路，导致EGFR-TKIs获得性耐药。在所有NSCLC的研究中MET作为靶点及KRAS信号激活剂做了研究，目前对肺癌效果较好的抑制剂包括小分子c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂（Tivantinib）及MET受体单克隆抗体（onartuzumab）。有研究显示，Tivantinib联合厄洛替尼并没有改善晚期NSCLC患者的预后，但患者的PFS有明显的改善（P<0.01）[26]。虽然Ⅲ期研究因缺乏疗效过早终止，但初步分析亚组似乎证实了上述结果。一个初期的Ⅱ期研究表明，onartuzumab联合厄洛替尼治疗MET阳性的NSCLC患者，有较好的预后[27]。

热休克蛋白（HSP）是分子伴侣，参与蛋白质的翻译后折叠和合成。HSP90抑制剂可干扰致癌驱动基因的正常功能，包括突变的EGFR、BRAF、HER2和EML4-ALK。有研究报道，HSP90抑制剂ganetespib联合多西他赛治疗KRAS突变的NSCLC，未能改善患者的PFS和OS，且HSP90抑制剂ganetespib联合MEK和PI3K/mTOR抑制剂的研究中发现，其加大了对KRAS突变细胞的细胞毒活性[28]。

2展望

尽管随着医学发展，肺癌的治疗取得了飞速发展，尤其是NSCLC的靶向治疗取得了突破性的进展，但对于KRAS基因突变的NSCLC靶向治疗仍然是一个具有挑战及吸引力的靶向治疗目标。但是抑制KRAS下游效应分子（PI3K、BRAF、mTOR、MEK）显现出令人期待的发展前景，特别是下游效应分子抑制剂联合使用会有较大的发展空间，我相信在不久的将来针对KRAS基因的靶向治疗会为NSCLC患者带来更有效的治疗。

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【关键词】角膜营养不良，遗传性;，基因;，突变;，序列分析，DNA;，聚合酶链反应;，系谱

摘要:目的以基因突变分析一角膜营养不良家系的致病分子基础。方法应用PCR产物直接DNA测序及限制性内切酶分析检测家系中7例患者和6例表型正常成员的K3、K12和BIGH3基因突变情况。结果该家系患者成员在K3与K12基因的编码序列区没有发现突变，而BIGH3基因外显子12存在CGG>TGG(R555W)突变杂合子，家系表现正常成员及正常对照均无BIGH3基因突变;限制性内切酶分析结果显示突变与疾病表现型呈完全共分离。结论利用基因突变分析确诊我国首例报道的Meesmann角膜营养不良家系属于颗粒状角膜营养不良，且为BIGH3R555W杂合突变类型。

关键词:角膜营养不良，遗传性;基因;突变;序列分析，DNA;聚合酶链反应;系谱

ABSTRACT:ObjectiveMoleculargeneticanalysisofalargeChinesecornealdystrophykindred.MethodsThirteeninpidualsincludingsevenaffectedandsixunaffectedfamilymembersinthisgranularcornealdystrophykindredwerestudied.GenomicDNAwaspurifiedfrombloodperipheralleukocytes.AlloftheexonsofboththeKeratin3andthekeratin12genes，andtheexon4andexon12ofBIGH3genewereamplifiedusingpolymerasechainreaction(PCR)，followedbydirectbidirectionalsequencingformutationdetection.

Themutationwasconfirmedbyrestrictiondigestanalysis.ResultsDirectsequencingofthepatients'genomicDNArevealedtherewasnomutationinalloftheexonsofK3andK12genes，butamissensemutation(CGG>TGG)intheexon12ofBIGH3(R555W)wasfound.Thismutationinthisfamilycompletelycosegregateswiththediseasephenotype.ConclusionThiskindredwasdiagnosedwithgranularcornealdystrophyharboredaheterozygousR555WmutationoftheBIGH3gene.

KEYWORDS:cornealdystrophy，hereditary;genes;mutation;polymerasechainreaction

基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C0510009)，福建医科大学科学研究发展基金资助项目(FJGXY04020)

角膜营养不良(cornealdystrophy)是一组与遗传有关的原发性、具有病理学组织学特征的疾病。目前，已确定与角膜营养不良的致病基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S2和GSN等。BIGH3基因突变至少可导致4种类型的角膜营养不良，包括颗粒状角膜营养不良(R555W)、Avellino角膜营养不良(R124H)、格子状角膜营养不良(R124C)和ThielBehnke角膜营养不良(R555Q)[1]。K3和K12基因突变导致Meesmann角膜营养不良[2]。笔者研究的家系为福建医科大学附属第一医院眼科普查时发现，先证者在裂隙灯下检测可见双角膜中央区有散在的细小圆形小泡，位于上皮层，斜照时呈散在的灰白点状，后照亮下呈透明小气泡样，临床表现为Meesmann角膜营养不良[3]。2004年，笔者随访该家系，家系图谱表现为常染色体显性遗传;在裂隙灯下检测先证者，发现不仅角膜上皮层受累，而且累及角膜实质层，临床表现为颗粒状或Avellino角膜营养不良。笔者对该家系进行分子遗传学分析，以确定其类型与致病分子机制。

1对象与方法

1.1对象

家系3代38人，受累患者12人，获得其中7例受累患者和6例非受累正常家系成员的血样标本，10例无眼疾正常人的血样标本作为正常对照组(图1)。:获取血样标本的家系成员.

1.2试剂和仪器

PCR所用试剂、琼脂糖凝胶、溴化乙锭(EB)、BstXⅠ和DNA分子量标记等(大连宝生物公司);PCR扩增BIGH3基因外显子12的引物序列:BIGH3e12F:5’CAGCGTGGTGAGGTATTTAAGG3BIGH3e12R:5’GTAGTAAAGGCTTCCCAGGGTT3’

1.3基因组DNA提取

取外周血样3mL，置于EDTAK3抗凝的真空采血管中;按WizardGenomeDNAPurificationKit(Promega)说明书提取基因组DNA。

1.4聚合酶链反应(PCR)

PCR反应体系25μL，包括10×PCR缓冲液(20mmol/LMg2＋plus)2.5μL、dNTPmix(2.5mmol/Leach)1μL、PCR上游和下游引物(10μmol/L)各1μL、基因组DNA(约100ng)1μL和TakaRaExTaqTM0.25μL、ddH2O补足25μL;PCR反应条件为:94℃3min94℃30s55℃30s72℃30s，30个循环;72℃3min。

1.5PCR产物直接测序

2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特异性后，PCR产物直接送大连宝生物公司测序。

1.6限制性内切酶分析

BIGH3R555W位点突变产生一个新的限制性内切酶位点，可被BstXⅠ识别(BstXⅠ识别序列为:CCANNNNN/NTGG);酶切反应体系20μL，45℃3h。

2结果

2.1K3和K12基因突变检测

Meesmann角膜营养不良是由K3和K12基因突变所致，且目前发现的突变全部分布在K3和K12角蛋白高度保守区HIM(helixinitiationmotifs)和HTM(helixterminationmotif)区域[2，4]。首先筛查文献已报道的K3和K12基因突变区域，即K12基因的外显子1和外显子6以及K3基因的外显子7。DNA测序结果表明在这些区域没有突变，进一步扫描K3和K12基因整个外显子区域，也未发现突变。2004年随访，裂隙灯检测发现症状发生改变，先证者的临床表现可能为颗粒状或Avellino角膜营养不良(图2)。

2.2BIGH3基因突变检测

PCR扩增BIGH3基因外显子4和外显子12，DNA直接测序分析，结果显示患者(先证者Ⅱ7和Ⅲ1)在BIGH3基因的外显子12发生杂合突变(CGG>TGG)，即BIGH3R555W突变(图3A);另外，在两位患者的BIGH3基因外显子12还发现一个多态位点(Phe540Phe)(图3B);内切酶BstXⅠ分析结果显示该家系的BIGH3R555W突变与疾病表现型呈完全共分离(图3C)，表明该例Meesmann角膜营养不良家系属颗粒状角膜营养不良，且为BIGH3基因R555W突变杂合子。

3讨论

角膜营养不良一般依据病史和裂隙灯检测可作出初步的临床诊断，且主要按病变发生的解剖学部位将其分为前部、实质部和后部角膜营养不良三类。然而，在进行性病变过程中，角膜营养不良还表现一个共同特点，即开始先侵犯角膜的某一层，晚期可波及邻近层次，甚至影响全层角膜。因此，A:DNA测序分析突变位点;B:BIGH3单核苷酸多态性位点(T/C);C:限制性内切酶BstXⅠ分析.

在临床诊断分型，特别是晚期患者的诊断分型带来很大的混淆。随着角膜营养不良分子遗传学的深人研究，以致病基因的分子特征作为临床诊断和分类、分型的依据，其可靠性和准确性也得到了大大提高，并且越来越受到国内外同行们的广泛认可。

分子遗传学分析结果显示，笔者研究的家系受累患者存在BIGH3R555W突变杂合子，突变与疾病表现型呈完全共分离，而在K3和K12基因没有发现突变。因此，从基因突变分析结果可以确诊该家系不属于Meesmann角膜营养不良，而是典型的颗粒状角膜营养不良。

据报道在该家系中先证者角膜病变开始发生于上皮层[3]，随后波及角膜实质部。因此，结合临床症状与基因突变分析，该家系患者又可能是BIGH3R555W杂合突变导致的角膜上皮层与基质层先后受累的颗粒状角膜营养不良，可归于浅表变异型颗粒状角膜营养不良。Escribano等研究表明角膜上皮细胞特异性高表达BIGH3基因[6];Hirano等认为BIGH3蛋白是由上皮细胞合成，内皮细胞也可能合成BIGH3蛋白[7];Okada曾报道一种由BIGH3R555W纯合子突变导致的浅表变异颗粒状角膜营养不良[8]。这些报道间接说明BIGH3R555W杂合突变也又可能导致浅表变异型颗粒状角膜营养不良。遗憾的是没有先证者的早期裂隙灯照片及组织病理检测来直接支持这种可能性。

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【关键词】川奇消食化积口服液；小鼠淋巴瘤细胞株；TK基因突变

TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidinekinase，TK）基因的突变，具有很高的灵敏度，广泛用于检测外来化合物的遗传毒性[1]。该测试系统可检测外来化合物引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价保健食品引起突变的可能性，本文采用TK基因突变试验评价川奇消食化积口服液的致突变性。

川奇消食化积口服液的主要成分为山楂、鸡内金、白扁豆、茯苓，可促进消化吸收，用于消化不良者。我国对化合物（包括食品污染物、药物、化妆品等）的常规遗传毒性评价方法包括：①细菌试验（Ames试验）；②哺乳动物体细胞突变试验、小鼠骨髓细胞微核试验、染色体畸变试验；③哺乳类生殖细胞突变试验[2]。

本文采用TK基因突变试验检测川奇消食化积口服液的致突变性。tk+/-基因型细胞突变为tk-/-基因型细胞后能拮抗三氟胸苷（TFT）而存活，据突变集落形成数，计算突变频率，可判定受试物的致突变性[3]。本研究发现，按1%体积比给药，受试物原液、1/2原液、1/4原液、1/8原液四个剂量组均未产生细胞毒性，在活化状态及非活化状态下均不具有致突变性。

[1]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003.

关键词：非小细胞肺癌ELM4-ALK融合基因EGFR突变基因

正文

肺癌是全球发病率及病死率最高的恶性肿瘤，其中，非小细胞肺癌的传统治疗方法有化疗，放疗，手术等。随着肿瘤发病机制研究的不断深入，分子靶向治疗已经成为了研发热点，并初步取得了显著疗效。EGFR，EML4-ALK等靶点的分子抑制剂在临床上的成功让学者们将更多的精力投入到靶向分子的研究中，2011年ASCO大会提示肿瘤诊疗已经进入分子靶向治疗的时代。以往大部分的研究都认为，非小细胞肺癌中EML4-ALK多数情况下与EGFR及KRAS突变是相互排斥的[1-3].近期陆续发现有EML4-ALK融合基因和EGFR突变共存的案例。在强调个体化治疗的时代，这部分患者其临床表现有何特点？该如何治疗？本文将就这些问题进行探讨。

EML4-ALK融合基因的分子结构及在NSCLC的发生率

ALK(anaplasticlymphomakinase间变淋巴瘤激酶)是一个由1620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族[4]。

EML4-ALK融合基因是由日本学者Soda等在一名62岁有吸烟史的男性腺癌NSCLC患者的肿瘤组织中首次发现的。基因的重排发生在2号染色体短臂上的2区1带和2区3带。ALK基因的3′端与EML4基因的5′倒位融合，EML4基因断裂后形成不同长度的外显子拼接片段，插入位置相对保守的ALK基因的19号、20号外显子之间[5]，融合基因的ALK部分均为20外显子编码的酪氨酸激酶结构片段，而EML4部分则为不同的外显子片段，从而形成有11个变体的EML4-ALK融合蛋白[1,2,5-10]，融合基因大多都有致瘤性[11,12]。

文献报道[13]，不加选择的NSCLC患者EML4-ALK融合基因总发生率为3.4%（范围0.4%-11.6%）。东方人群NSCLC患者的总发生率为4.1%，欧美人群为2.5%。Shaw等[8]在女性，亚裔，不吸烟或者是轻度吸烟（每年吸烟≤10包或戒烟≥1年者）这4个条件中至少满足2个条件的141名肺腺癌患者的肿瘤组织中用FISH法检测了EML4-ALK融合基因的发生率，结果显示其发生率高达13%；在EGFR和KRAS均为野生型的不吸烟/轻度吸烟者则为33%。Zhang等[3]用RACE-coupledPCRsequencing法在中国NSCLC患者中进行检测，结果表明在中国的非选择性NSCLC患者中该融合基因的发生率为11.6%，EGFR和KRAS均为野生型的不吸烟/轻度吸烟者则高达42.8%。

EGFR突变基因的分子结构及发生率

EGFR（epidermalgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体）具有受体酪氨酸激酶活性，属于Ⅰ型生长因子受体家族，由1个胞外配体结合区，跨膜区和一个胞内区构成。

EGFR基因位于7号染色体短臂的12-14区，由28个外显子组成，突变多位于19-21外显子（酪氨酸激酶功能区），其突变主要有3种类型：a.19外显子碱基缺失改变了受体ATP结合囊（ATP-bindingpocket，ABP）角度，增强了肿瘤细胞对TKI的敏感性[14,15]。Shigermatsu等[16]发现外显子19突变的发生率最高，占EGFR突变总数的50%以上；b.20外显子点突变或碱基插入突变20外显子的点突变主要是第790位密码子出现C-T转换，从而引起该处的苏氨酸转变为甲硫氨酸（T790M），这一突变多见于药物治疗后的复发患者，突变后肿瘤细胞对TKI产生抵抗[17]，插入突变出现在第770-775位密码子，插入片段为3-9个碱基，其临床意义目前尚不清楚[16]；c.21外显子点突变主要是851位密码子出现T-G转换，亮氨酸转变为精氨酸（L858R），突变提高了肿瘤细胞对TKI的敏感性。

在非选择性NSCLC患者中，EGFR在美国的非小细胞肺癌腺癌患者中突变率约为15%[18]，在亚裔人群为30%-50%,且大部分是腺癌和支气管肺泡癌。

EGFR-TKI、ALK-TKI抑制剂与靶向患者的疗效

EGFR的抑制剂Gefitinib和Erlotinib目前已经广泛应用于临床的各线治疗。IPASS研究[24]比较了一线使用EGFR-TKI与一线使用化疗药物的疗效，该研究结果验证了EGFR突变对吉非替尼治疗NSCLC疗效的预测作用，EGFR突变患者是吉非替尼治疗最大获益人群。基于IPASS及其他三项小型临床试验的研究结果，ASCO于今年4月了PCO(ProvisionalClinicalOpinion)，建议对晚期初治的NSCLC患者进行EGFR突变测定以决定患者是进行EGFR-TKI治疗还是进行化疗[25]。

EML4-ALK与EGFR临床特征及异同

EML4-ALK融合基因型患者与EGFR基因突变型患者有相似的临床特征[8,19]，多见于不/轻度吸烟的腺癌患者，但EML4-ALK融合基因型患者多为年轻的男性患者，且不能从EGFRTKI治疗中获益[8]。

以往的文献多认为EML4-ALK融合型基因与EGFR基因突变是互为独立的分子事件[1,5,8,20,21]，EML4-ALK融合型基因可能是继KRAS之后的EGFR对TKI耐药的另外一个原因[8]。但目前已报道有4例[3,5,22,23]EML4-ALK融合型基因与EGFR基因突变共存型患者。#p#分页标题#e#

台湾大学附属医院的Kuo等[22]报道了一例EML4-ALK融合型基因与EGFR基因突变共存对EGFRTKI治疗有效的患者：72岁亚裔女性腺癌（Ⅳ期脑，骨转移）不吸烟初治患者，经RT-PCR和DNA测序证实的EML4-ALK融合基因（亚型1）与EGFR突变（19外显子缺失突变delE746-A750）共存。经过92天的吉非替尼治疗之后，CT显示右上肺的肿物显著性缩小，CEA从442.1ng/ml降至87.6ng/ml。

Tiseo等[23]报道了一例48岁的不吸烟高加索男性腺鳞癌患者（大部分的鳞癌混合>10%的局限性低分化腺癌），cT1N0M1(左侧第10肋)，顺铂+吉西他滨治疗了6周期后PET评估肺部病灶PR，肋骨转移灶CR。之后患者行右上肺叶，淋巴结，肋骨切除术。肺部的主要病灶为EGFR19外显子缺失突变，KRAS野生型，ALK野生型。转移的淋巴结病灶有EML4-ALK融合基因（经FISH验证）。3个月后患者复发，接受Erlotinib150mg/天（两个月）治疗，无临床受益，最终死于疾病进展。

展望

EML4-ALK融合基因是当前研究的热点，其已成为NSCLC的一个亚型，PF-023451066（crizotinib)的Ⅲ期临床试验正在进行，Crizotinib能否像EGFRTKI一样成为NSCLC治疗上的一个里程碑，让我们拭目以待。EGFRTKI目前已经广泛应用于临床的治疗，在治疗晚期EGFR突变的NSCLC患者中疗效显著。但对于EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变共存型患者，目前的研究和报道还很少，仍有许多问题值得思考和研究：EML4-ALK融合基因与EGFR突变基因究竟是同时存在于同一个肿瘤组织中还是分别存在于一个肿块之中？共存型患者其EML4-ALK与EGFR的下游的分子生物学行为如何？两个案例报道中患者对EGFRTKI的反应恰好相反，是否因为EML4-ALK不同亚型对EGFRTKI的敏感性不同？对于共存型患者该如何应用TKI？多靶点抑制剂会不会是共存型患者的更好选择？期待有深入的实验研究和临床研究来解决这些问题，使患者以最小的花费取得最佳疗效，真正在基因水平上实现肺癌的个性化治疗。

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【摘要】

【关键词】鼻咽肿瘤辐射耐受性突变肿瘤细胞培养的DNA修复色谱法高压液相基因型

DNA分子是恶性肿瘤放疗辐射作用的靶点，细胞对电离辐射反应的分子基础是DNA损伤[1]。DNA双链断裂是放射治疗过程中的主要损伤形式，而细胞内产生的DSBs可以通过同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复。未修复的DSBs损伤将导致细胞死亡。近年来的研究表明，DNA修复基因突变、单核苷酸多态性均可改变DNA的修复能力。因此检测DNA修复基因的分子状态可能成为个体肿瘤放疗敏感性的预测指标。XRCC4是DNA损伤修复的主要基因之一，缺乏XRCC4的细胞特别容易受到离子辐射的伤害。XRCC4基因的突变可能影响肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，进而影响其对辐射的敏感性以及放射治疗的疗效。因此，XRCC4基因的突变检测可为其与肿瘤放射敏感性关系的研究以及探讨作为肿瘤个体放疗敏感性的预测指标的可行性提供研究基础。

1对象和方法

1.1对象收集2002年9月-2003年9月福建省肿瘤医院放疗科经病理确诊、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年龄(48±12.71)岁(21～76岁);女性21例，年龄(48±11.15)岁(26～69岁)。治疗前经鼻咽镜取鼻咽活检组织。DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司);TaqDNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因扩增仪(PTC200，美国BIORADDNAENGINE公司);DHPLC(4500WAVE，美国Transgenomic公司)。

1.2方法

1.2.1基因组DNA抽提用组织DNA抽提试剂盒抽提患者鼻咽部癌组织基因组DNA，核酸蛋白检测仪定量，-20℃保存备用。

1.2.2PCR引物设计与合成人类XRCC4基因有8个外显子，因为此基因突变多发生于其1号、4号、7号和8号外显子，其中第8外显子较长，需分成2个相互重叠的片段进行扩增，故选择这4个外显子设计5对引物。引物由上海博鸿生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引物序列Exon1R

FCCGGAAAAGGCGGGATTTAG

GGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4R

FGTGTATGCTTAAAACCAGGC

AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7R

FTCAATGCTAAAACAGCAAGT

GATTCAAACATTTTACAATTCCExon81R

FCTTTTACTCTATAACAGAAGTT

ATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82R

FGTGAATTGAAACCATTGTGC

GGTTACATTTACATTAATAAGCAGT

1.2.3PCR反应体系及条件PCR反应体系50μL，含0.2mmol/LdNTP，1.5mmol/LMg2+，DNA模板100ng，TaqDNA聚合酶1.25U，上下游引物各0.2μmol/L。PCR反应条件：94℃变性10min94℃40s54℃～64℃45s72℃35s，循环35次，72℃延伸10min，PCR产物用1%琼脂糖(含溴化乙锭0.5μg/mL)凝胶电泳检测。

1.2.4DHPLC筛选XRCC4突变对有效扩增的PCR产物行DHPLC筛查突变，检测PCR反应产物，其分离柱固相为烷基化C18，中间桥分子为TEAA，洗脱缓冲液主要成分为乙腈。标本上机之前通过软件分析序列的理论温度分离曲线，摸索出最佳的分离温度后进行突变筛选分析。

1.2.5DNA测序根据DHPLC系统检测结果，将不同峰型的PCR产物送日本TAKARA公司进行DNA序列测定。

2.1DHPLC筛查结果每份样本均检测上述5个片段的PCR产物，每份样品在50℃的非变性温度下均为对称性单峰;在部分变性的温度下，1号、4号、7号和8号外显子的81片断均为单个色谱峰，只有8号外显子的82片断的扩增产物出现杂合峰与纯合峰两种情况，单个色谱峰显示为纯合链，双峰或三峰表示是杂合异源双链。出现杂合峰显示有突变的异源双链存在。不同样品的PCR产物的8号外显子82段在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同(代表峰形见图1)，提示8号外显子的82段具有单一类型的突变。

2.2DNA测序结果选择DHPLC检测为杂合峰与单个峰的标本测序，测序结果显示28例患者的XRCC4基因第8号外显子第377位碱基C变成T(图2)。

本研究通过PCRDHPLC筛查，共检测了88例患者XRCC4基因各5个片段的PCR产物，在部分变性的温度下，28例患者的8号外显子82所扩增的片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况，经DNA测序分析证实单个色谱峰样本未测出突变，双峰或三峰样本检测出突变，即8号外显子第377位碱基C变成T，此外，不同样品的PCR产物的8号外显子在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同，提示8号外显子具有单一类型的突变。该变异导致126号密码子的serphe，致使氨基酸残基发生替代变化(丝氨酸苯丙氨酸)，这一替代对改变DNA修复能力的作用以及是否影响鼻咽癌细胞DNA损伤修复能力和放射治疗疗效，还有待于进一步的研究探讨。

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【摘要】目的探讨急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia，AML)患者人Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复(Fmsliketyrosinekinase3intenaltandemduplication，FLT3ITD)基因突变及其临床意义。方法采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerasechainreactiondenaturinghighperformanceliquidchromatography，PCRDHPLC)方法检测60例初治AML患者和10例对照组骨髓FLT3ITD基因突变。结果60例AML患者FLT3ITD突变阳性率21.67%(13/60)，10例对照组均未检测到该突变;FAB各亚型FLT3ITD突变率不同，有M3型突变率较高的趋势;FLT3ITD阳性组外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性组(P

【关键词】急性髓细胞白血病;FLT3;内部串联重复;基因;聚合酶链反应变性高效液相色谱技术

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatethemutationofFLT3internaltandemduplication(ITD)inpatientswithacutemyeloidleukemia(AML)anditsclinicalsignificance.MethodsThemutationofFLT3ITDinbonemarrowsamplesfrom60patientswithdenovoAMLand10controlgroupswasdetectedbypolymerasechainreactiondenaturinghighperformanceliquidchromatography(PCRDHPLC).ResultsTherewere13outof60(21.67%)AMLpatientsidentifiedwithFLT3ITDmutation，whichwasnotidentifiedin10ofthecontrolgroups.DifferentFABsubtypesofAMLhaddifferentmutationrate，andM3hadanobviouslyhighermutationratethanothersubtypes.TheperipheralwhitecellcountandbonemarrowblastcellsweresignificantlyhigherinpatientswithFLT3ITDmutationthaninthosewithout(P

KEYWORDS:acutemyeloidleukemia;FLT3;internaltandemduplication;gene;polymerasechainreaction-denaturinghighperformanceliquidchromatography

人FLT3是Ⅲ型酪氨酸激酶受体(receptortyrosinekinase，RTK)家族成员的原癌基因，其蛋白产物属于受体，定位于细胞膜上。在正常人骨髓中，FLT3的表达仅限于CD34+干/祖细胞，该受体与多种胞浆蛋白作用介导一系列细胞内信号传导，诱导细胞增殖和分化。近来研究发现FLT3基因的异常表达、突变与急性白血病(acuteleukemia，AL)的发生、发展、预后有密切关系[13]。酪氨酸激酶受体基因FLT3的内部串联重复序列(FLT3internaltandemduplications，FLT3ITD)是一种FLT3的近膜区的突变，由NAKAO等[4]研究急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia，AML)时，于1996年首先报道。为探讨AML患者FLT3ITD的突变情况，我们采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerasechainreactiondenaturinghighperformanceliquidchroma

tography，PCRDHPLC)技术检测60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突变情况并分析其临床意义。

1材料与方法

1.1研究对象60例初治AML患者，诊断及疗效标准参照《血液病诊断及疗效标准》[5]。男27例，女33例，中位年龄48岁(18～79岁)。FAB分型为M03例，M13例，M214例，M313例，M413例，M512例，M62例，M70例。老年AML30例(年龄>60岁)，非老年AML30例，正常人及良性血液病患者为对照组共10例(3例健康人，5例缺铁性贫血患者，2例特发性血小板减少性紫癜患者)。

1.2实验方法采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(PCRDHPLC)方法。①DNA制备。取患者骨髓液2mL，应用美国Promega公司DNA提取试剂盒抽提总DNA。测定吸光度A260nm/A280nm值，确定DNA的纯度及浓度，并以去离子水稀释DNA样本为1g/L。②PCR扩增。应用PrimerExpressV2.0软件包以13号染色体外显子14、15设计引物，包括整个近膜区(JM)和激酶结构起始部分，扩增产物为329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正义引物：5′GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3′;反义引物：5′CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3′。PCR反应体系(50μL)：10×PCR缓冲液5μL，25mmol/LMgCl26μL，10mmol/LdNTP1μL，10μmol/L正/反义引物各2μL，模板DNA4μL，TaqDNA酶0.5μL，双蒸水29.5μL。PCR条件：94℃，5min，1个循环;94℃，45s，56℃，45s，72℃，45s，共循环35次;72℃延伸10min，1个循环。③测序分析。部分变性DHPLC分析突变阳性产物：5μL预处理的PCR产物上样于Transgenomic公司的DNAsep分离柱，然后观察DHPLC图谱形态。发现异常的图谱形态PCR产物，纯化后测序(由大连宝生物生物公司帮助完成)，分析各FLT3ITD序列。

1.3统计学方法应用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析。计量资料在作t检验、方差分析前先进行正态性、方差齐性检验，单变量两组资料采用t检验，方差不齐者采用非参数检验;计数资料采用卡方检验，P

2.1AML患者FLT3/ITD基因突变的检测60例初发AML患者，13例FLT3ITD突变阳性患者(21.67%)，其中M221.4%(3/14)，M330.8%(4/13)，M423.1%(3/13)，M525.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未检测到该突变，有M3型突变率较高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。本实验检测的突变均为杂和突变，各例突变区域大小不等(6～100bp)，均为框内突变。10例对照组均未检测到突变。

2.2FLT3ITD阳性AML患者临床特征60例初治AML组中，13例FLT3ITD突变阳性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差异无统计学意义(P>0.05);30例老年AML组，8例FLT3ITD突变阳性，突变阳性率26.7%，30例非老年AML组，5例FLT3ITD突变阳性，突变阳性率16.7%，二者相比差异有统计学意义(P

2.3FLT3ITD阳性AML患者的疗效采用DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)方案治疗;M3首选维甲酸;13例FLT3ITD阳性AML患者6例获得CR(46.2%)，47例FLT3ITD阴性AML患者34例获得CR(72.3%)，二者相比差异有显著性(P

FLT3ITD突变是近年来AML中最常见的突变类型之一。正常情况下，酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸激酶拮抗调节维持平衡的。如发生基因突变，将导致酪氨酸激酶持续活化，进而阻断对细胞的分化、增殖和凋亡调节功能，与肿瘤发生有密切关系。有研究表明[67]，约有19.2%～32.0%的AML患者存在有FLT3ITD突变，在成人新发AML的阳性率22.9%，在老年AML的阳性率为31.4%，在FAB亚型中，FLT3/ITD突变在M3的阳性率最高，M5次之，M2、M6的阳性率较低。我们检测的结果显示，在AML中FLT3ITD突变阳性率为21.67%，其中M3最高，M5次之。说明FLT3ITD突变在AML患者的疾病发生、发展中起一定作用，也提示FLT3ITD对于M3可能是一个预后不良的指标。

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关键词：遗传性对称性色素异常症；ADAR基因；基因编码区

Abstract：ObjectiveTodetecttheADARmutantgeneinthefamilyofhereditarysymmetrypigmentabnormalities.MethodsclinicaldataofpatientswithperipheralbloodDNAextraction，allPCRamplificationofADARgeneencodingregionofexonandflankingsequences，PCRproductswerepurifiedanddirectlysequenced，andcomparedwiththegenomicsequence，findnomutation.ResultsNomutationswerefoundinalltheexonsandflankingsequencesofthecandidategenecodingregion.ConclusionTheADARgenecodingregionisnotrelatedtothepathogenesisofhereditarysymmetrypigmentabnormalitiesinthisstudy.

Keywords：Hereditarysymmetrypigmentabnormalities；ADARgene；Genecodingregion

遗传性对称性色素异常症（Dyschromatosissymmetricahereditaria，DSH）是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病。主要表现为散在分布于手足背的对称性色素沉着及色素减退斑，少数伴有面部雀斑样损害，可延及四肢及全身[1]。2003年张学军等[2]将该病的致病基因定位于1q11～1q21区域。Miyamura等[3]将该病的致病基因确定为ADAR基因。我们收集到1个DSH家系，利用PCR和直接测序方法进行突变检测，以期发现在该家系中是否存在ADAR基因突变。

1资料与方法

1.1一般资料先证者：女，6岁。双手足背出现色素异常4年，皮疹渐加重，无不适。系统查体：未见明显异常。皮肤科检查：双手足背可见米粒至黄豆大小褐素沉着斑，夹杂色素减退斑，见图2、图4。面部散在粟粒至黄豆大小色素沉着斑，见图1。父母非近亲结婚。家系调查：先证者父亲，31岁，自3岁起双手足背、面部出现与先证者相似皮损，见图3、图5、见图6。亦呈夏重冬轻现象。无其他自觉症状。系统查体：未见明显异常。皮肤科检查：双手足背可见米粒至黄豆大小褐素沉着斑，夹杂色素减退斑。面部散在粟粒至黄豆大小色素沉着斑。家系图，见图7。组织病理检查：（先证者父亲右足背色素斑）表皮轻度角化过度，表皮基底细胞灶性黑素减少与增加交替分布，真皮浅层血管周围少许淋巴细胞浸润，见图8、图9。诊断：遗传性对称性色素异常症。

1.2材料与方法

1.2.1外周血基因组DNA提取。

1.2.2PCR扩增及DNA测序ADAR基因，见表1。

ABIPRISM3730XL自动测序仪直接测序。测序结果利用Sequeneher4.10.1Demo软件与基因组标准序列进行比对分析。

2.1基因突变检测

遗传性对称性色素异常症（DSH），系常染色体显性遗传病，最先由Toyama于1910年描述，并于1929年正式命名。婴儿期或儿童期发病。张学军等首次将本病定位在1q11-1q21区间内，该区间内的双链RNA特异性腺苷脱氨酶基因（ADAR）被证实是本病的致病基因。迄今已超过140种不同的ADAR基因的突变报道，其中约60%的突变点位于编码ADEAMc区的碱基序列上，因此有笔者认为ADEAMc区是该病基因的突变热点区域。本家系2位患者ADAR基因的15个外显子编码区及侧翼序列进行测序未发现任何致病突变。刘红等曾对8个DSH家系进行ADAR的直接测序，其中的2个家系也未发现任何突变，分析原因可能位于内含子区域、5'端启动子区域。考虑到遗传异质性，原因还可能是致病基因ADAR之外的其它基因。至今中国人遗传性对称性色素异常症的分子遗传学研究报道中尚未发现除ADAR基因编码区以外的突变位点。因此定位汉族人群中该病的易感基因或筛查已知易感基因的突变类型仍是该病的一个研究方向。本家系致病基因的定位研究，仍在进行中。

[1]赵辨.中国临床皮肤病学[M].第1版.南京：江苏科学技术出版社，2010.1479.