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【关键词】
国家管辖范围外海域；UNCLOS；公海自由；人类共同继承财产
《联合国海洋法公约》（UnitedNationsConventionontheLawoftheSea，简称UNCLOS）将海洋空间为若干区域，国家管辖权之外的海域，包括“区域”以及公海两个部分。由于此海域的生物多样性资源更是新型海洋资源，故而现有法律规定尚不能对其进行有效的规制。从生物多样性保护的法律规定来看，《生物多样性公约》（ConventiononBiologicalDiversity，简称CBD）的主旨是在国家管辖范围内的海洋生物多样性的保护。具体而言，这两部公约关于国家管辖范围之外海域生物多样性的法律属性均未做出明确规定，国际社会为解决这一争议举行了诸多会议进行讨论，但结果只是对国家管辖权范围外海域海洋生物多样性对人类社会的重要性，及需为其制定保护措施达成一致共识，但未对资源的法律属性归属形成结论性的意见。这是因为，资源属性这一问题牵涉到各国的根本利益，任何的妥协都会对本国利益造成难以弥补的损失。因此，在这一问题上，各国很难达成一致。
一、国家管辖范围之外海域生物多样性现有争议
目前而言，国家管辖范围之外海域海洋生物多样性资源的法律属性是发达国家和发展中国家争议最大的地方，在国际会议中争论激烈。
欧盟国家认为现有的法律制度和管理执行方面均存在着空白，应当从处理具体执行差距的基础上，制定新制度完善现有法律框架。他们提议制定UNCLOS第三个执行协定，重点是在公海建立海洋保护区，以确保有效的海洋环境管理。
二、国家管辖范围之外海域生物多样性资源属性法律理论
（一）公海自由原则
（二）人类共同继承财产原则
三、国家管辖范围之外海域生物多样性资源法律属性分析
对于“区域”生物多样性资源的法律属性归属，应当选择“人类共同继承财产”，第一，国家管辖范围之外海域生物多样性资源的生存环境与普通海域不同，极端环境下所具有的独特生态系统造就了动植物独特的生存能力和生存方式，成就了其资源的独特性以及人类社会对这一资源的不可复制性。这种这种独特的地理生态环境造就了海洋生物多样性资源极高的价值，因此该资源与“区域”地理环境具有高度的伴随性，甚至可以说，国家管辖范围外海域海洋生物多样性资源与“区域”是一个密不可分的整体，与“区域”环境不可分割；第二，海洋法的健全完善，不但受时代背景的影响还受科学水平的左右。在UNCLOS关于“区域”资源定义做会议讨论之时，关于国家管辖范围外海域生物多样性资源并没
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关键词：土壤类型；烟田土壤微生物；根土比；多样性指数
土壤类型对微生物生长发育有着较大影响。土壤类型不同，土壤微生物种群数量和组成也必然会存在某种程度的差别，这种差异反过来又会对土壤结构以及土壤肥力特别是对烟草的生长产生一定的影响[5]。土壤微生物是土壤中动植物残体分解的主要推动者，在土壤物质转化中具有多种重要作用，与土壤肥力和植物营养有密切关系。因此土壤微生物是反映土壤供肥能力、土壤健康状况的敏感性参数。为此，在湖北省保康县和兴山县选取两种有代表性的土壤类型，研究不同类型土壤中主要微生物类群数量的变化规律，为合理利用土地资源、保证其可持续发展提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验设计
试验于2009年5～12月在湖北省保康县和兴山县进行。选取黄棕壤和紫色土两种土壤类型，育苗、肥水管理、病虫害防治及其他田间管理均按照当地农民种植习惯进行。供试烟草品种为K326。
1.2土壤样品采集
分别于移栽前期（5月12-13日）、旺长期（7月8-9日）及采收期（8月15-16日）取样。采用5点取样法采集5～20cm根际土和非根际土，用无菌自封袋包装，立即带回实验室。将新鲜土样研磨过2mm筛存放在4℃冰箱中。
1.3土壤微生物测定
采用稀释平板法测定土壤微生物总数；细菌采用牛肉膏蛋白胨固体培养基；固氮菌采用阿须贝氏琼脂培养基；放线菌采用高氏1号培养基；真菌采用马丁氏（Martin）培养基。结果以每克干土所含微生物数量表示[6]。
1.4数据分析
根土比（R/S）是指根际土中微生物数量与非根际土中微生物数量的比，其中R表示根际土中微生物数量，S表示非根际土中微生物数量。
微生物数量变化速率是指根际土中微生物数量与移栽前期根际土中微生物数量的比。
生物多样性指数是描述生物类型数和均匀度的一个度量指标，它在一定程度上可反映生物群落中物种的丰富度及其各类型间的分布比例。本研究中土壤微生物菌群多样性指数和土壤微生物菌群的均匀度计算方法如下：
1）土壤微生物菌群多样性指数（Shannon-Wiener指数[7]）：H=-∑Pi×1nPi
2）土壤微生物菌群的均匀度[8]：
R=（-∑Pi×1nPi）/1nS
式中，Pi=Ni/N为某群落中第i个类型的个体数占总个体数的百分比，S为微生物类群数量。
2结果与分析
2.1不同类型烟田土壤中微生物数量
由图1至图4可知，在不同土壤类型烟田土壤中4种微生物数量从多到少依次为：细菌、固氮菌、放线菌、真菌。其中，细菌数量最多，占微生物总量的58.77%～82.98%，固氮菌占微生物总量的10.80%～32.75%，放线菌占微生物总量的3.79%～10.39%，真菌数量最少，占微生物总量的0.04%～0.22%。由此可见细菌在烟田土壤微生物中占绝对优势。
在不同生育时期不同土壤类型的烟田土壤中，旺长期细菌数量高于采收期，保康县黄棕壤和紫色土烟田旺长期土壤中细菌数量分别为11.7402×107cfu/g和11.6542×107cfu/g，兴山县黄棕壤和紫色土烟田旺长期土壤中细菌数量分别为29.4370×107cfu/g和11.2959×107cfu/g。
不同类型的烟田土壤中，黄棕壤中细菌和固氮菌数量均高于紫色土，保康县黄棕壤烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.7402×107cfu/g和24.0334×106cfu/g，保康县紫色土烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.6542×107cfu/g和15.1630×106cfu/g；保康县黄棕壤烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.2504×107cfu/g和34.5517×106cfu/g，保康县紫色土烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为10.3028×107cfu/g和31.9386×106cfu/g。兴山县黄棕壤烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为29.4370×107cfu/g和99.0073×106cfu/g，兴山县紫色土烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.2959×107cfu/g和32.7666×106cfu/g；兴山县黄棕壤烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为16.6946×107cfu/g和66.2752×106cfu/g，兴山县紫色土烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为7.6790×107cfu/g和23.9568×106cfu/g。
2.2不同类型烟田土壤中微生物数量变化速率
以移栽前期根际土中微生物数量为参照，不同类型烟田土壤中微生物数量变化速率如图5和图6所示，黄棕壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率都高于1，表明在烟草生长过程中黄棕壤烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌数量在增加，而紫色土中固氮菌和放线菌的变化速率存在低于1的情况，表明在烟草生长过程中紫色土烟田土壤中固氮菌和放线菌数量存在减少的趋势。
在黄棕壤烟田土壤中，细菌变化速率高于固氮菌变化速率，固氮菌变化速率高于放线菌变化速率，放线菌变化速率高于真菌变化速率。在兴山县黄棕壤烟田旺长期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为6.8955、4.1618、2.5611和1.5299。
在不同类型烟田土壤中，黄棕壤烟田土壤中细菌变化速率、固氮菌变化速率、放线菌变化速率和真菌变化速率分别高于紫色土中4种微生物变化速率。兴山县黄棕壤烟田采收期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为3.9107、2.7859、2.6590和2.1364，兴山县紫色土烟田采收期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为1.6365、1.5277、1.5838和1.9117。
2.3不同类型烟田根际土中微生物根土比
由图7和图8可知，不同类型土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌根土比都大于1，表明根际土中细菌、固氮菌、放线菌和真菌数量均高于非根际土，表现出明显的根际效应。不同类型烟田土壤中，黄棕壤中固氮菌根土比高于紫色土，兴山县黄棕壤中固氮菌根土比最高，为7.0071。黄棕壤中4种微生物根土比之和高于紫色土，旺长期保康县黄棕壤和紫色土中4种微生物根土比之和分别为5.9583和4.8209，旺长期兴山县黄棕壤和紫色土中4种微生物根土比之和分别为13.8522和6.7424。
2.4不同类型烟田土壤中微生物种群结构变化
细菌与真菌数量的比值（B/F）是表征土壤肥力的一个潜在指标。有资料表明，土壤中细菌密度高，表明土壤肥力水平较高。表1为不同土壤类型烟田土壤中微生物的B/F变化趋势。黄棕壤烟田土壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）高于采收期，兴山县黄棕壤烟田土壤中旺长期和采收期细菌与真菌数量的比值（B/F）分别为26.4314和11.5417。不同类型烟田土壤中，黄棕壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）几乎都高于紫色土，兴山县黄棕壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）最高，为26.4314。黄棕壤烟田土壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）高于紫色土，表明黄棕壤烟田土壤更适合烟草种植。
2.5不同土壤类型对土壤微生物多样性指数的影响
土壤微生物菌群多样性指数（H）反映微生物群落的丰富度，用根际土中微生物菌群多样性指数与非根际土中微生物菌群多样性指数之比（R/S）衡量烟叶种植对烟田生态系统中微生物多样性指数的影响。从表2可知，黄棕壤根土比大于紫色土。保康县黄棕壤和紫色土根土比分别为0.88718和0.74894，兴山县黄棕壤和紫色土根土比分别为1.01926和0.86643。
3小结
对不同类型的烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌进行分离，对不同微生物种群进行数量和多样性分析。结果表明，不同类型烟田根际土壤中，黄棕壤中细菌和固氮菌数量均高于紫色土。在黄棕壤烟田土壤中，细菌变化速率高于固氮菌变化速率，固氮菌变化速率高于放线菌变化速率，放线菌变化速率高于真菌变化速率。黄棕壤烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌变化速率分别高于紫色土中4种微生物变化速率。黄棕壤中4种微生物根土比之和高于紫色土，兴山县黄棕壤中固氮菌根土比最高。黄棕壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）几乎都高于紫色土，兴山县黄棕壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）最高，为26.4314。黄棕壤根际土中微生物菌群多样性指数与非根际土中微生物菌群多样性指数之比高于紫色土。
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Abstract：BasedonthecomparativestudyofthenumberandgroupsofbacteriaininsideandoutsideoftheXiaotongziForestsoil（0-30cm）inShuangbaiCounty，thispapermadevarianceanalysisanddiversityindicesanalysisonthebacteria.Aftertherelatedexperiments，theresultsshowthat：thenumberofbacteriainsideandoutsidetheforesthasasignificantdifference（p
关键词：小桐子林地；细菌群落；细菌多样性
Keywords：XiaotongziForest；bacteriagroups；bacteriadiversity
0引言
1.2材料
1.2.1土样的采集土壤样品于2011年8月采集于云南双柏县，采集0cm-30cm表层，5cm为一个层次，共7个层次。
1.2.2使用到的试剂本实验主要使用牛肉膏蛋白胨培养基。如图2。
1.3主要实验方法及实验步骤
1.3.1测定土壤的含水量先称取待测土壤的样品，在烘干冷却后称其重量，根据以下公式计算其含水量：土壤含水量=（湿土重-干土重）/湿土重×100%。
1.3.2测定土壤的微生物，采用比较常见的测量方法――稀释涂布平板法。
2.1土壤细菌的数量分布（如图3）
表1为土壤细菌数量值及其差异。方差分析表明：不同采样点小桐子林土壤细菌在土壤中的垂直分布存在差异。土壤细菌数量在各个样地有共同特点，即30cm处土壤细菌数量最少，在15cm处最多，5cm层细菌数量比0cm层多。
2.2林内林外小桐子林地土壤细菌群落多样性分析林内样地土壤细菌4种多样性指数除丰富度指数（S）外，其它均小于林外样地。林外样地Shannon多样性指数比林内样地高0.3%，说明调查样地林内与林外物种丰富度相近（图4）。
3.2两样地表层的细菌数量都比较少，这种原因主要是土壤类型不同，这些土层比较浅，土壤中有含有大量砂砾，在土壤厚度增加的同时，其紧实度、致密度也随之增加。过于致密的土壤不利于透气、透水，这种不利条件限制了有氧细菌的生长。
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关键词：环境工程；分子生物；微生物；应用
前言：作为集环境监测、环境工程、保护学以及微生物学于一体的学科，微生物学在不断发展中逐渐衍生出较多亟待解决的问题。尽管近年来有较多先进理念与技术被引入该学科中，但对于部分环境监测或环境净化等问题，所取得的效果并不理想，要求充分发挥分子生物技术的优势。因此，本文对环境工程微生物中分子微生物技术的应用分析，具有十分重要的意义。
1.1测序技术
细胞中的rDNA本身表现出明显的高突序列、保守序列以及稳定特征，但其是分类微生物中的指标之一。通常测序分析中，为使微生物种群得以分析，对分离物或分类单元进行确定，便需借助rRNA分析方式。从该基因序列的类型看，有较多如16SrRNA、23SrRNA与5sRNA，其中后两者包含的含核苷酸分别过多与过少，很难为测序分析提供指导。所以在原核生物系统研究中，可考虑将16SrRNA引入。具体测定中，会在如TA克隆试剂、PGEM-T克隆试剂等载体应用下，克隆PCR产物，完成文库构建过程，在此基础上结合16SrRNA基因测序结果，可通过其与文库中的序列做好对比，判断是否有相对应或相似微生物种类。另外，也可对rDNA多样性利用电泳分离进行显示，或直接通过RFLP对扩增产物做好分析。通过这些测序方法的应用，对微生物系统发育的研究可起到重要作用[1]。
1.2核酸技术
1.3基因探针
目前分子生物技术中，基因探针的引入主要借助荧光染料、放射性同位素，对样品内核酸进行识别分析。对于该技术，也表现在核酸印迹、荧光原位以及放射性标记探针等技术方面。其中放射性探针应用下，尽管对于寡核苷酸、RNA或单链DNA等都可进行标记，但其涉及的同位素具有较高的成本，很容易危害人体健康，所以使用中受到较大的限制。而对于荧光原位，应用中一般可做好细菌空间位置标识或定量定性判断细菌情况等工作。另外，在核酸印迹方面，其适用对象集中表现在PCR扩增产物方面，对微生物风度、多样性检测都可起到重要作用[2]。
2环境工程微生物领域中分子生物技术的应用分析
2.1微生物群种丰度与多样性的分析
现行环境工程领域中，通常需检测的对象多表现在底泥、土壤、生物膜以及污泥方面。从现行较多实践研究都可发现，若将16SrRNA从菌落中提取出来并开展测序工作，可对微生物种群在活性污泥中的情况被测定，并将聚光激光扫描、荧光显微以及FISH等技术引入，可定位生物膜中的微生物或检测其活性。再以城市地区垃圾填埋细菌的分析，可在ARDRA方法的运用下，使细菌多样性情况以及细菌结构被有效判断。这些都可充分说明微生物丰度、多样性都可在分子微生物技术应用下被有效判断，通过定量或定性检测得到的结果，能够为环境工程中较多工艺操作、构筑物设计提供参考。
2.2指示微生物与致病菌的有效检测
环境工程研究中，可发现在土壤、水体或空气等媒介作用下，致病菌很可能对人体造成较大威胁，如典型的SARS。对此，便可借助分子微生物完成致病菌测定工作，如部分学者将16SrRNA基因、PRC-DGGE技术共同引入，对垃圾场、污水处理厂以及大学校园中的空气环境进行测定，可发现在以往微生物培养下，很难测定气溶胶微生物情况。另外，对于水体内是否有大肠杆菌等DNA存在，也可借助分子微生物技术进行判断。这些都可充分说明，对于指示微生物、致病菌的检测，分子生物技术应用效果都较为明显。
2.3功能微生物的培养
由于当前化工行业发展步伐较快，其带来的过多有机化合物也成为环境工程领域面临的难题，很多有机化合物如含苯环类型，很难实现快速降解目标。对此问题，大多学者通过实验方式，发现分子生物技术应用下可使这种现状得以改变，如对甲苯质粒、降解萘利用DNA印迹杂交形式，可使这两种质粒微生物被判断。此外，对于其他难以降解的有机物，都可采用质粒如工程、基因重组等方式，使功能群被构建，使有机物难以被降解的问题得以解决[3]。
3结论
分子生物技术的应用是现行微生物研究的重要保障。实际引入该技术中，应正确认识分子生物技术的实现原理，包括测序技术、基因探针以及核酸技术等，在此基础上将其融入致病菌检测、功能微生物培养以及微生物多样性分析等方面，能够推动环境工程微生物学的进一步发展。
参考文献
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双生子研究是一种经典的流行病学研究方法，主要通过对双生子群体的研究，即比较同卵双生子和异卵双生子性状的相似性来判断遗传和环境哪种对于疾病或性状更为主要的一种方法。同卵双生子（monozygotictwins）具有基本相同的遗传物质，表型特征极为相似。同卵双生子之间的差异可以排除遗传因素的作用，可用以研究不同环境因素对表型的影响。异卵双生子（dizygotictwins）具有50%相同的遗传物质，其在特点上无异于两次不同妊娠的同胞，但双生子同胞之间具有相同的年龄，进行比较时可以避免年龄的混杂，同时也可以排除不同子宫环境对胎儿发育及疾病所带来的影响。通过比较同卵及异卵双生子性状的差异，可以分析遗传和环境两个方面对个体性状的影响。本研究拟通过双生子法，以聚合酶链反应-变性梯度[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]凝胶电泳（polyme-rasechainreaction-denaturinggradientgelelectropho-resis，PCR-DGGE）分析双生子儿童口腔微生物群组结构构成的差异，从而观察遗传及环境因素对人口腔微生物群组结构构成的影响。
1材料和方法
1.1试验对象
随机选取2011年8月—2012年3月于四川大学华西口腔医院儿童口腔科就诊的双生子儿童20对，年龄3～11岁，根据WHO口腔健康调查基本方法第三版龋病诊断标准，记录龋失补牙面（dmfs/DMFS）指数。其中有龋者17人，无龋者23人。
所有入选双生子儿童为共同生活背景，无全身系统性疾病史，3个月内无全身使用抗生素史，未使用激素类药物及免疫抑制剂，1周内口腔局部未使用抗生素。儿童及其法定监护人知情同意。
根据儿童牙列情况分为乳牙列组以及混合牙列组。乳牙列组双生子共10对，年龄3～6岁，其中无龋（cariesfree）儿童13人，有龋（caries）儿童7人，dmfs指数为2.29±1.38。混合牙列组双生子共10对，年龄6～11岁，其中无龋儿童10人，有龋儿童10人，dmfs/DMFS指数为7.20±4.42。
1.2卵形鉴定
用无菌棉签采集儿童口腔黏膜样本，鉴定双生子儿童卵形。采用16个多态标记（D3S1358，vWA，FGA，AMEL，D8S1179，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，TH01，PE，D16S539，CSF1P0，PD，TPOX）的基因分型对所有双生子进行卵形鉴定。20对双生子中，同卵双生子10对，异卵双生子10对；乳牙列组中同卵双生子3对，异卵双生子7对；混合牙列组中同卵双生子7对，异卵双生子3对。
1.3唾液样本采集
进食后2h取样，清水漱口后采集非刺激性唾液，直接用加样枪从受试者口底采集，采集量为5mL。采集的唾液放入离心管内，冰浴下2h内放入-80℃冰箱冻存。
1.4DNA提取
将临床采集的唾液样本在室温下解冻，将唾液样本混合，2600×g离心10min，沉淀样本中的残渣及真核细胞，取上清，14000×g离心5min，弃上清，收集细菌沉淀用于提取DNA和PCR-DGGE分析，以获得原始唾液细菌谱。利用QIAampDNAMicroKit提取全基因组DNA，提取产物使用Pigogreen荧光定量法测定浓度，A260/A280测定DNA纯度。
1.516srRNA基因扩增及PCR-DGGE分析
使用通用引物bal1（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACTACGTGCCAGCAGCC-3’）、bal2（5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’）扩增DNA样本16srRNA基因，扩增产物长度约300bp。PCR反应体系：PCRmastermix预混液25μL，25mmol·L-1引物各1μL，100ng纯化基因组DNA，加去离子水补足50μL。循环条件：起始步骤94℃变性3min；94℃变性1mi[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]n，56℃退火1min，72℃延长2min，30个循环；72℃延长5min。取PCR扩增产物5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，0.5μg·mL-1溴化乙锭染色后置长波紫外光下观察。
以8%的聚丙烯酰胺凝胶形成40%（含2.8mol·L-1尿素及24%甲酰胺）至60%（含4.2mol·L-1尿素及24%甲酰胺）的线性浓度梯度。每个加样孔中加入约300ng的PCR产物。将凝胶浸没于装有1×TAE缓冲液（40mmol·L-1Trisbase，40mmol·L-1冰醋酸，1mmol·L-1乙二胺四乙酸）的电泳槽中，使用Bio-RadDcode系统恒定60V电压，58℃下电泳17h。电泳完成后，TAE缓冲液漂洗凝胶，含0.5μg·mL-1溴化乙锭的1×TAE缓冲液染色15min后用1×TAE漂洗15min洗去多余染料。使用MolecularImagerGelDocumentationsystem获取并记录PCR-DGGE凝胶的数码图像[3]。
1.6数据分析
使用Quantityone软件标记PCR-DGGE图谱条带，并使用非加权组平均法（unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA）构建系统发育树，得到相似性矩阵（similaritymatrix）。使用Quantityone软件导出实验数据后，计算多样性指数（Shannonindex）及PCR-DGGE条带数。
采用SPSS16.0软件进行统计分析。数据服从正态分布者采用独立样本t检验，不服从者采用独立样本t’检验。
2结果
2.1PCR-DGGE图谱分析
乳牙列组PCR-DGGE图谱见图1。泳道2～6、8、11为有龋者，7、9、10、12～21为无龋者。
2.2UPGMA系统发育树
乳牙列组UPGMA系统发育树见图3。2-3、4-5、6-7、10-11、14-15、16-17、18-19为异卵双生子，8-9、12-13、20-21为同卵双生子。除6-7这对双生子外，其余9对双生子之间均出现明显聚类（90%），但同卵双生子和异卵双生子间无统计学差异（P>0.05）。混合牙列组UPGMA系统发育树见图4。1-2、3-4、7-8、9-10、11-12、13-14、19-20为同卵双生子，5-6、15-16、17-18为异卵双生子。6对双生子之间有明显聚类（60%），但同卵双生子和异卵双生子之间无统计学差异（P>0.05）。
在乳牙列组中，同卵双生子的相似性为75.70±1.70，异卵双生子的相似性为71.83±6.69，两者间无统计学差异（P=0.21）；混合牙列组中，同卵双生子的相似性为58.53±10.37，异卵双生子的相似性为57.87±21.51，两者间无统计学差异（P=0.86）。这说明在乳牙列及混合牙列同卵及异卵双生子中，口腔微生物组成的相似性无明显差异，遗传因素对口腔菌群微生物构成的作用可能小于环境因素。
2.3口腔微生物多样性分析
双生子儿童口腔微生物PCR-DGGE条带数及多样性指数分析见表1。乳牙列组中，有龋儿童的PCR-
DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，且两者间均具有统计学差异（P<0.05）。混合牙列组中，有龋儿童的PCR-DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，但两者间均无统计学差异（P>0.05）。
3讨论
PCR-DGGE[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]是一种非培养指纹图谱方法，通过PCR-DGGE方法可以在同一块胶上观察不同的细菌种类。利用细菌16SrRNA基因进行PCR特异性扩增结合DGGE分析已成为研究微生物群落多样性的常规方法。本研究发现乳牙列组有龋儿童中，唾液细菌的多样性较低，而无龋儿童唾液细菌的多样性较高。在混合牙列双生子中，虽然无龋与有龋儿童的细菌多样性无统计学差异，但仍能看出患龋后微生物多样性减少的趋势。推测其可能的原因是：有龋儿童口腔内可能有更高比例的产酸菌及耐酸菌[4-5]，且其口腔微环境可能更适合致龋菌的生存，所以致龋菌的比例升高，从而导致细菌整体丰度下降[6-7]。
在本研究中，通过PCR-DGGE聚类分析可以发现，大多数双生子出现明显聚类，其中，乳牙列双生子中有9对出现明显聚类（90%），混合牙列双生子中有6对出现明显聚类（60%），这证明在大部分双生子之间，口腔菌群微生物构成的相似性非常高。但同时可以看到，无论是乳牙列还是混合牙列，同卵双生子和异卵双生子之间的口腔菌群相似性均没有明显差异，说明在口腔微生物菌群构成中，环境因素（共同生活等）的影响可能更大于遗传因素。同时，乳牙列儿童双生子的口腔菌群构成相似程度（90%）与混合牙列双生子的菌群构成相似程度（60%）不同，这与其他学者[8]的研究结果相吻合。
Corby等[9]的研究显示，遗传因素对唾液中的细菌定植有显著影响。其他学者[10]的研究也证实遗传因素对人及动物模型中唾液变异链球菌的定植及龋易感性均有明显影响。本研究结果也显示，有龋儿童及无龋儿童唾液微生物的种类有所不同，有龋儿童的唾液微生物种类减少。在同卵及异卵双生子中，均发现有较高的口腔微生物菌群相似性，而这种相似性在同卵双生子及异卵双生子之间没有发现差异。混合牙列双生子中口腔微生物的相似性低于乳牙列双生子，可以由此推测，在口腔微生物菌群构成中，环境的作用可能大于遗传的作用。
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【关键词】牙髓病；根尖周病；微生物检测；分子生物学
【中图分类号】R781.3
【文献标志码】A
微生物种类繁多，自然界中仅有极少数微生物得到了鉴定，能够在实验室培养的种类则更少，至多为1％。传统的牙髓感染细菌厌氧分离培养影响因素多，鉴定困难。随着分子生物学技术的发展，更多的微生物在根管中检出。16SrD-NA指纹技术、克隆文库、核酸杂交等技术的应用使人们对牙髓根尖周病微生物组成的认识更加全面，对于进一步分析其协同作用等致病机制有所帮助。
116SrDNA指纹技术
指纹技术都是基于聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）基础上的，其特异性的扩增产物代表着微生态系统中的微生物多样性。传统指纹技术有末端限制性长度多态性（terminal-restric-tionfragmentlengthpolymorphism，T-RFLP）、变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelec-trophoresis，DGGE）和温度梯度凝胶电泳（tem-pe-raturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。传统指纹技术主要根据扩增产物不同的解链特性，使相同相对分子质量的DNA分子根据碱基组成特点得以分离，已广泛应用于微生物生态系统研究。
2004年，Hommez等将T-RFLP法应用于感染根管细菌组成的研究中；但是没有强大的数据库支持，通用引物扩增存在偏嗜性，酶切后T-RFLP的长度分布也会低估复杂群落的多样性，这些问题使这种实验方法尚没有完全发挥其潜能。
DGGE是在聚丙烯酰胺凝胶中加入线性梯度的DNA变性剂，在不同的变性剂浓度下，DNA分子解链的程度不同，当DNA分子解链到电泳时产生的迁移阻力与电场力相平衡时，便停留在这一特定变性剂浓度的凝胶带中，从而使相同的相对分子质量的DNA分子根据碱基组成特点得以分离。Siqueira等应用DGGE方法比较了挪威及巴西慢性根尖周炎患者感染根管的细菌组成，分别检出了9.2和10.5个细菌条带，由此得出，感染细菌的组成在样本个体间差异明显，同一地区样本的细菌组成具有相似性。
利用指纹技术研究菌群组成已被证实是可行的，通过比较指纹图谱可以了解不同个体或者不同生境的菌群组成差异。
2实时荧光定量PCR技术及属、种特异性PCR
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、无污染、具实时性和准确性等特点，定量PCR技术在牙周致病菌检测等方面已经应用多年。
Rocas等讨论了粪肠球菌的出现与不同类型根尖炎之间的关系，实验选择扩增特异性高的巢式PCR对样本16SrDN段进行扩增，在原发感染的50例患牙中粪肠球菌的检出为9例，阳性率为18％；而在30例无症状的已经进行根管充填但是伴有慢性根尖病损的患牙中粪肠球菌的检出率为20例，阳性率为66.7％。这个结果表明粪肠球菌在无症状的患牙中检出率高于有症状的患牙，提示粪肠球菌的存在与根尖病持续感染关系密切。
Siqueira等设计了应用特异性探针检测牙髓感染异性细菌存在的实验，分别于2001年、2003年检测到牙髓感染中的产黑色素菌、福赛斯拟杆菌、丙酸丙酸盐杆菌及伴放线放线杆菌的存在。
3构建16SrDNA克隆文库
Subramanian等对已切除的34例持续性根尖周炎的根尖及其周围的炎症组织样本进行了实时定量PCR检测，并对其中16例进行了16SrDNA克隆测序，得出以下结论：1）切除的根尖样本中细菌的总量远远高于根尖周炎症组织中的细菌总量；2）根尖样本中含有大量尚未培养的细菌。粪肠球菌及洋葱布克菌在所有样本中占主导地位；纤细弯曲菌和格氏链球菌多见于根尖样本；牙缝奇异菌、微小消化链球菌属、链球菌属C8、小杆菌属E2_20E1及真菌菌株A35MT多见于根尖周组织样本。
由此可见，采用构建16SrDNA克隆文库的方法所测得的菌群较为全面，敏感性和特异性均较高；但该方法工作量较大，费用高，研究样本量较少。此外，使用该方法分析环境微生物菌群还受到目前基因文库库容量的影响。Kemp等运用多种统计学方法分析比较了文献报道的225个来自多种环境的16SrDNA文库的组成，发现随着库容量的增大，菌群分类单位总是在增加，这一结果说明几乎没有哪一个文库可以完全包括样品中多样性的微生物种类；而且这种实验方法存在16SrDNA通用引物特异性较差以及PCR过程中高浓度模板竞争等问题，导致一些丰度小的菌种可能无法被检测出。
4.1基因芯片技术
基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交一致，利用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与半定量的分析。
Rocas等利用基因芯片技术检测持续性根尖周炎患者根管内的微生物群，选取了28种特异性探针与感染根管内细菌扩增产物进行杂交，链球菌属的检出率为47％，乳杆菌属的为35％，小类杆菌属的为29％，其中8个菌属菌量大于105，其中链球菌和齿垢密螺旋体最为常见。特异性探针扩增粪肠球菌及白色假丝酵母菌的阳性率分别为47％和6％。感染多为混合感染，即使检出粪肠球菌的存在，其也不一定是感染的优势菌。
由于采样方法可能造成细菌种类和总量的误差，Rocas等研究了已拔除的无法保留的持续性根尖周炎患牙，将牙根分切为根尖1／2和根管上段1／2，进行低温下研磨并提取总DNA进行了同样的杂交检测，实验同样选用28种特异性探针，检出率分别是：牙龈欧氏菌（76.5％）、保氏普雷沃菌（71％）、牙髓卟啉单胞菌（65％）、具核梭杆菌（53％）、福赛斯坦纳菌（47％）。其中，牙龈欧氏菌、牙髓卟啉单胞菌及痤疮丙酸杆菌在根尖区更为常见，保氏普雷沃菌、福赛斯坦纳菌和具核梭杆菌在根尖段及根管上段的检出率并无差异，而链球菌属在根管上段的检出率则较高。
DeSantis等利用含297851个16SrDNA探针的高密度芯片对3种环境样本的微生物种类进行了分析，并与传统的16SrDNA克隆测序方法进行了比较，结果表明，芯片技术虽然不能鉴定新菌种，但在分析环境样本时比克隆测序方法获得了更多的生物多样性信息。
4.2荧光原位杂交技术及流式细胞技术
荧光原位杂交技术是一种不依赖PCR的分子分析技术，它利用带荧光标记的特异性核酸探针与靶序列杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号来确定靶序列分布的方法。它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然的微生物环境中检测鉴定微生物个体，并对微生物群落进行评价，目前已应用到肠道微生物菌群的研究中。Colombo等通过原位杂交结合激光共聚焦显微镜观察健康成人与慢性牙周炎患者牙龈上皮内细菌聚集情况，发现牙周炎患者牙龈上皮细胞内细菌聚集量显著高于健康成人；但荧光原位杂交技术存在样本自身产生荧光、探针特异性不足等缺点，所以需要结合其他分子生物学技术才能得到更多有用的信息。
流式细胞技术（flowcytometry，FCM）是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞各类性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选。
用FCM进行DNA指纹图谱分析是快速鉴别和诊断细菌的一种新方法。该法将限制性片段长度多态性分析与FCM相结合，具有快速、可靠性好等优点，利于检测新出现的未知菌。
分子生物学的实验方法将人们的视野扩展到了不可感知的领域，它的高度敏感性、特异性，操作的标准化、规范化，使人们从依靠培养进行实验的时代大大跨越了一步。人们可以检出更多种的细菌，并可以对其进行定量研究，但是在研究个别可疑致病菌的致病机制的同时，也要注重菌群之间的相互作用，以及从生态学角度分析菌群的组成，回归到它们的整体作用上来，进而全面了解疾病进程并为实施有效的干预提供帮助。
2生物多样性影响评价基本内涵与主要内容
2.1基本内涵
生物多样性保护是生态和环境保护的核心内容之一，而环境影响评价是从源头保护生物多样性的重要途径。农业规划环评中生物多样性影响评价的基本内涵就是：农业规划实施对规划区域的遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性可能带来的影响进行分析、预测与评估，提出避免、预防或减轻不良影响的对策和措施，建立监测机制并跟踪评价，持续改进达到保护目的。
2.2主要内容
农业规划生物多样性影响评价的主要内容有4方面：
（1）分析预测规划实施可能会影响到实施区域生物多样性的哪些方面。关于生物多样性影响评价的分析尺度，目前比较公认的是遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性。随着景观生态学的发展，将景观生物多样性纳入生物多样性保护的层次；
（2）对影响可能造成的后果加以评价包括短期影响、长期影响、直接影响、间接影响、累积影响等，影响是否有利，是否可恢复等。
（3）针对生物多样性各层次的影响，需要采取哪些预防和保护措施；
（4）建立长期监测生物多样性的机制，跟踪和预测生物多样性的变化趋势。
3农业规划环境影响评价中生物多样性影响评价基本程序
根据农业规划环评中生物多样性影响评价的基本内涵，其基本程序包括规划分析、现状调查与分析、影响要素识别、影响预测与评价、预防和保护措施、监测与跟踪评价等。
3.1规划分析
3.2现状调查与分析
根据生物多样性的层次及保护需要，调查农业规划实施区域生物多样性历史演替过程和现状。重点调查分析以下区域的生物多样性：（1）具有生态学意义的保护目标；（2）具有美学意义的保护目标；（3）具有科学文化意义的保护目标；（4）具有经济价值的保护目标；（5）重要生态功能区和具有社会安全意义的保护目标；（6）生态脆弱区；（7）人类建立的各种具有生态环境保护意义的对象等[9]。
3.3影响识别、预测与评估
3.4预防措施与保护方案
由于农业规划实施范围较大，具有宏观性，规划环境影响评价的生物多样性保护也需从大的范围和宏观上进行把握。制定具体的预防措施和保护方案，应依次按照预防措施、最小化措施、减量化措施、修复补救措施、重建措施序列原则进行[9]。物种及其生境（栖息地）是各层次生物多样性表现形式和基础，对于重要物种的保护要以就地保护为主，迁地保护为辅。物种与其生境具有不可分割的联系，保护原生境及其里面的生物资源是保护生物多样性及其资源永存的最符合自然规律的手段，也是“生态系统方法”的基本原理之一。迁地保护措施也很重要，但它是在原生境遭到严重破坏和就地保护已经不可靠的情况下的辅助手段。
3.5监测与跟踪评价
由于生物多样性影响的表现具有滞后性特点，应建立长期监测机制，对生物多样性保护目标动态变化进行跟踪监测，分析生物多样性变化的趋势，预防可能产生不良影响的因素，及时调整保护措施，确保生物多样性保护的有效性。
4农区生物多样性影响评价层次及特点
农业是一种直接利用生物多样性的产业，包括直接利用生物多样性的资源材料以及模拟生态系统的初级生产（植物种植业）和次级生产（动物养殖业）等全部生产过程；而且还包括进一步利用生态系统中的有机物腐解过程使之转化为农业经济作物（食用菌养殖、微生物造肥、生产沼气等）。考虑到农业规划主要是在农区实施，这里的农区不是仅局限于种植业区域的“小农区”，是包括农牧渔业生产活动范围的“大农区”，因此，就农区和农业而言，生物多样性可分为农区遗传多样性、农区物种及生境多样性、农区生态系统多样性、农区景观多样性、农业产业结构多样性几个尺度水平[10-11]。
4.1农区遗传多样性影响评价特点
（1）农业活动使得生境破碎、消失引起物种种群缩小、消失导致遗传多样性丧失；
（2）外来物种入侵排挤当地种，使得遗传多样性丧失；
（3）农业新品种发展项目，对遗传多样性产生的影响；
（4）转基因作物可能引起的遗传多样性的变化及丧失[12]。由于受科学研究的限制，在现实中只对少量的物种进行过比较全面的遗传多样性研究，在遗传多样性层次评估生物多样性影响目前还不具有普遍意义。在环评工作中，建议把遗传多样性影响评价的内容与物种多样性、生态多样性影响评价融合在一起描述，更易于操作。
4.2农区物种及生境多样性影响评价特点
在我国几千年的农业栽培和养殖实践过程中，培育了大量食用与经济性能优良的作物、果树、家禽、家畜。我国栽培作物种和亚种有600多个，其中已知约237种为我国自古以来的土生栽培种，位居世界前列，被认为是世界三大农业起源中心之一。其中粮食作物30多种，蔬菜200多种，牧草与饲料作物约400多种。果树约300种，茶品种600多个，桑有15个种，共1000多个品种。家养动物品种和类群包括特种经济动物和家养昆虫在内，品种和类群有2000多个。除了农业经济物种外，在农田、湖泊与河流等湿地生态系统及荒山草坡生态系统中还有大量野生动植物物种和类群。稻田中野生动物主要以两栖类、爬行类动物和某些鸟类为主；重要杂草约有200多种。旱地生态系统中也生长着丰富的农作物伴生物种，如有记录的农田杂草有73科、560多种，对农作物有害的动物与昆虫约1300多种，天敌生物近2000种，其中仅棉田的重要天敌蜘蛛就有21科、89属、205种[11]。这些构成了我国农区物种及生境多样性。在环评实际工作中，对农业规划实施区域内的物种及生境的全部评价是不现实的，也不符合农业规划环评宏观性的特点。在满足农区生物多样性保护要求下，物种及生境多样性影响评价应针对区域关键物种及生境进行重点评价。
（1）保护物种。被国际、国家、地方、部门或保护组织明确列入保护名录的物种。主要评价保护物种分布状态、种群结构及现存数量、保护级别、濒危程度、生境特点、对环境的敏感程度、农业规划实施对保护物种的影响程度、就地保护和迁地保。护实施的可行性等；
（2）地方特有种。其分布范围狭窄、生境条件苛刻，当分布的区域环境改变，有可能造成这些物种灭绝。主要评价特有种的特有性（国际特有、国家特有、地方特有、区域特有）、濒危程度、生境特殊性、受影响程度、就地保护和迁地保护实施的难易程度等；
（4）栽培和家养生物的野生近缘种和野生类型。起源于我国的栽培作物不仅种类多，而且具有野生近缘种的也多，它们是农业生物多样性的宝贵遗传资源；家养生物的野生型是潜在进行品种改良的重要遗传资源。这些遗传资源的价值难以估量，在评价中应重点确认这些物种的存在、数量、生境条件、濒危程度、受影响和潜在影响程度、保护措施等；
4.3农区生态系统多样性影响评价特点
我国农区生态系统按其基本类型可以分为6类：农田（水田与旱地）生态系统、种植园（水果、干果、蔬菜、茶叶、桑、药材、花卉和其他特殊经济作物）生态系统、草原与草地生态系统、水产水域生态系统（陆地水域和海洋水域，与湿地生态系统基本类同）、集约化养殖场系统和农区边际土地生态系统[11]。农业规划实施不确定性的特征，在对农区生态系统多样性影响的质（影响性质、影响类型、影响因素）和量（影响程度、时空规律、发生概率）上有更多不确定性。农区生态系统多样性影响评价主要是：
（1）生态系统类型结构和功能完整性；
（2）生态系统的脆弱性和整体变化趋势；
（3）生态系统的服务功能及生态承载力；
（6）生态系统抗干扰的能力、恢复能力和生态系统的功能维系；
（7）预防与保护措施实施的可行性。
4.4农区景观多样性影响评价特点
4.5农业产业结构多样性评价特点
关键词：黄瓜；轮作；大葱；土壤；连作障碍
中图分类号：S642.2文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.008
研究表明，蔬菜连作会导致生长受阻，抗病能力减弱，产品产量和品质下降[1-2]。连作土壤与轮作土壤相比，理化性质变劣[3]，酶活性降低[4]，微生物数目及种群多样性减少[5]。黄瓜是设施主栽蔬菜，连作障碍已成为制约其高产高效和可持续发展的重要因素。试验发现，大葱轮作可显著减轻黄瓜连作土壤障碍，促进生长，提高产量[6]，对此，前人从根区土壤的理化和生物学特性方面进行了探讨[6-8]。根际是植物与土壤进行物质和能量交换最剧烈的区域，根际土壤的理化和生物学特性与非根际土壤明显不同[9]。本试验以黄瓜连作土壤为对象，比较研究了大葱-黄瓜轮作和黄瓜-黄瓜连作两种栽培模式对后茬黄瓜根际土壤理化和生物学性状的影响，以期探讨大葱轮作减轻黄瓜连作障碍的机理，为制定合理栽培制度提供理论依据。
1.1材料
供试土壤取自山东省泰安市岱岳区房村镇北滕村，为连续种植15年黄瓜的日光温室耕层土壤。土壤类型为棕壤，属砂壤土，土壤理化性状为pH值6.19，EC值825μS·cm-1，碱解氮238.0mg·kg-1，有效磷151.2mg·kg-1，速效钾131.2mg·kg-1。
供试黄瓜（CucumissativusL.）品种‘新津11号’，大葱（AlliumfistulosumL.）品种‘元藏大葱’。
1.2方法
1.2.1试验设计试验于2011年8月—2012年6月在山东农业大学园艺试验站日光温室内进行，设2个处理：大葱-黄瓜轮作（T），黄瓜-黄瓜连作（CK）。每处理30盆，随机排放。花盆直径30cm，高25cm，内装连作土壤10kg。装盆前向土壤中均匀混入复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）10g，生育期不再追肥。黄瓜、大葱分期播种育苗，2011年8月29日同时定植，黄瓜每盆1株，大葱每盆5株，12月20日拉秧。
后茬于2012年4月25日全部定植黄瓜，常规方法管理，6月20日拉秧。
分别于5月15日、5月25日、6月5日取样。每处理随机取5盆，利用雷娟利等[10]方法获得根际土样，混合均匀，研磨过2mm筛，一部分于4℃冰箱保存，用于土壤微生物分析；另一部分风干后过1mm筛，用于土壤酶和理化指标分析。
1.2.2测定方法
（1）土壤理化性状。pH值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁PHBJ-260便携式pH计测定，EC值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁DDB-303A便携式电导率仪测定；碱解氮采用碱解扩散法测定，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定[11]。
（2）土壤微生物数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养；放线菌采用改良高氏1号培养基培养（每1000mL培养基中加入3%重铬酸钾3.3mL）；真菌采用马丁氏培养基培养（每1000mL培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3mL，1%链霉素3mL）。微生物数量均采用系列稀释法计数[12]。
（3）土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定；过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定[13]。
1.2.3数据统计与分析采用DPS软件对数据进行方差分析及最小显著差异性检验。
2.1不同种植模式对黄瓜根际土壤EC值和pH值的影响
伴随生育期推进，黄瓜根际土壤EC值不断降低，生育初期轮作黄瓜的根际土壤EC值大于连作黄瓜，但定植40d后，EC值开始低于连作黄瓜（图1）。连作和轮作黄瓜根际土壤pH值缓慢升高，轮作黄瓜上升幅度大于连作黄瓜，6月5日轮作黄瓜的根际土壤pH值高于连作黄瓜土壤。
2.2不同种植模式对黄瓜根际土壤养分含量的影响
由图2可以看出，根际土中速效氮含量呈先升高后降低趋势，有效磷和速效钾含量则持续降低。生育初期，轮作黄瓜根际土壤中的速效氮、有效磷、速效钾含量高于连作土壤，尽管有效磷含量未达显著差异水平，说明前茬大葱吸收的养分较少。随着植株生长，轮作黄瓜根际土壤中有效磷含量迅速降低，以致低于连作土壤，速效氮与连作土壤无显著差异，速效钾含量却始终较高。
2.3不同种植模式对黄瓜根际土壤酶活性的影响
2.4不同种植模式对黄瓜根际土壤微生物群落结构的影响
从图4可以看出，随着黄瓜的生长，根际土中细菌、真菌和放线菌数目均不断增加，其中，细菌在土壤微生物群落中占绝对优势。根际土壤中细菌、放线菌和真菌数初期差异不大，后期轮作黄瓜根际土壤中细菌、放线菌数目显著高于连作黄瓜，真菌数则显著低于连作黄瓜。轮作黄瓜根际土壤中真菌数占微生物总量的比例低于连作黄瓜，6月5日土壤真菌所占比例分别为0.28%和0.54%。
设施连作障碍的一个重要原因是土壤酸化、次生盐渍化和养分失衡[14]。合理轮作可以降低土壤盐分积累，在一定程度上避免次生盐渍化的发生[15]。与连作相比，轮作黄瓜的根际土壤EC值降低速度较大，最后低于连作黄瓜根际土壤，可能与轮作植株生长势较强，吸收土壤中养分较多有关。王柳[16]发现，在不施肥或只施底肥情况下，黄瓜根区土壤pH值总体呈上升趋势。本试验中，伴随黄瓜生育，连作和轮作黄瓜根际土壤pH值均呈升高趋势，可能与只施用了底肥有关。
轮作黄瓜根际土壤中速效氮、有效磷和速效钾含量前期较高，说明前茬大葱吸收养分数量少于黄瓜。伴随生育进程，黄瓜根际土壤中养分含量快速降低，轮作黄瓜根际有效磷含量低于连作黄瓜，可能因为轮作黄瓜生长旺盛，对磷的吸收较多，同时磷在土壤中移动性较差[17]有关。土壤速效氮含量先升高后降低，可能由于根系生理活动使速效氮在根际发生了富集。钦绳武等[18]对氮素在根际迁移规律的研究中发现，氮素在旱作根际土壤中会出现富集现象。
土壤微生物群落结构的多样与稳定不仅可提高土壤微生态的稳定性，也可提高土壤的缓冲能力[20]。本研究结果表明，轮作黄瓜根际土壤中可培养细菌及放线菌数目均高于连作黄瓜，可培养真菌数目则低于连作黄瓜，与杨凤娟[8]、吴凤芝[21]研究结果一致，表明轮作可以改变土壤微生物群落结构，改善土壤的微生态环境。
本试验结果表明，大葱轮作后的黄瓜根际土壤理化及生物学性状得到明显改善，可作为防控设施黄瓜连作障碍的一种有效种植模式。
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自可持续发展理念提出以来，人们越来越重视对生态自然环境的保护。其中，林业的发展为社会经济发展提供所需要的木材。然而，由于不加节制的开采，造成对森林生态环境的破坏。为此，退耕还林政策的实施对于改善生态环境具有重要作用。本文主要研究退耕还林的基本内涵与需要遵循的原则，且深入地研究退耕还林在改善生态环境方面发挥的作用，旨在推动我国社会经济健康可持续发展。
关键词：
退耕还林；改善生态环境；作用；研究
环境是人们赖以生存的基本条件，自然环境质量的好坏，直接影响着人们的生活与经济发展质量。然而，在经济快速发展的同时，向自然界索取大量的林木资源，造成对生态环境不同程度的破坏。为此，通过采取退耕还林的政策，对我国生态环境加以改善，不仅是贯彻落实科学发展观的必然要求，更是践行可持续发展理念的重大举措。
一、退耕还林的内涵
按照我国林业局对于退耕还林所作出的定义可以得知，退耕还林的创立与实施以多个角度为出发点。就环境保护方面而言，通过退耕还林的实施，有步骤性、计划性地改善荒漠化与水土流失严重地区。在加强对自然生态环境保护的同时，更将以各个地区的特点为出发点，适当地种植多样性的植被，对于恢复原有植被以及保护生物多样性都具有重要作用。退耕还林政策实施的过程是一个兼具科学性与系统性的过程。具体表现为以下两个方面：一方面是采取有效的措施以改善存在水土流失问题的地区，相应地增加多样性植被的种植；另一方面，通过造林方式对荒漠山地加以改造。因此，退耕还林政策的实施，既可以改善生态环境，又可以推动经济发展，兼顾好经济效益与生态效益，在满足社会发展需求的同时，加强对生态自然环境的保护，是造福人类的重大举措。
二、退耕还林的原则
三、退耕还林对改善生态环境的作用
1加强对水土流失的控制
通常情况下，在未实施退耕还林以前，多数陡坡耕地种植条件恶劣，在雨水以及地表水的冲刷作用下，极容易引发水土流失的问题，石漠化现象严重。通过对大部分陡坡耕地进行造林绿化，生态环境不断改善。新种植的地表植被通过发达的根系固定土壤，枯落物逐年累积，降低了地表水的冲刷力度，从而实现对水土流失的有效控制。
2恢复植被多样性
在实施退耕还林政策之前，地表的植被非常稀疏，植被样式以杂草与庄稼为主，种类非常单一。通过退耕还林乔-灌-草结合的多层次立体结构种植，退耕地植物种类丰富各异，不仅科学合理地实现了地表植被的多样性发展，使群落环境相对稳定，最大程度地发挥了生态效益。
3改善空气的质量
在退耕还林政策实施之后，种植了多种植物配置模式的地表植被，成片的森林减少了沙尘天气的发生，降低了危害。种类丰富的植物能够吸收大气中的二氧化碳并释放氧气，对生态系统及大气平衡有着重要的意义。林草植被达到一定面积后，对区域内小气候的影响较为显著，森林在蒸腾作用下，能够降低气温，提高地面湿度，甚至增加降雨，逐渐改善区域生态环境。
4改善土壤的性质
退耕还林实施后，地表累积逐渐增厚的枯落物层形成了天然的保护，有效地截留降雨、减少雨水对地表的侵蚀，减弱了雨水对地表的直接作用。同时枯落物经过微生物分解作用释放有机物，土壤有机质含量增加，土壤质量得到提高、土壤结构得到优化，增强了土壤抵抗冲击、侵蚀以及自我修复的能力。
5旱涝灾害的缓解
在退耕还林政策实施之前，不仅地表植被覆盖率较低，而且存在严重的水土流失问题，甚至会造成河流阻塞以及引发旱涝灾害等。在退耕还林政策实施之后，通过增加地表植被，有效地固定土壤，减少了地表径流对土壤的侵蚀，缓解江河湖库的泥沙淤积，从而实现对洪涝灾害的有效控制。同时，通过森林植被对小气候的改善，地面附近降温增湿，降低了干旱威胁程度。因此，退耕还林政策的实施，是减轻旱涝灾害的重要方式。
6提升生物的多样性
在实施退耕还林政策之前，地表植被较少，缺乏多种生物的生存空间，耕地环境中生物物种也相对单一。退耕还林实施之后，为动物的栖息和繁衍增加了更多空间的同时，也为微生物提供了就地保护的良好场所，对于保护生物的多样性、维持生态环境稳定具有重要意义。结语：综上所述，退耕还林政策的实施，在增加森林覆盖率的同时，减少水土流失，进一步地改善区域小气候，达到净化空气、改善环境的效果。因此，应当重视退耕还林政策实施，这为自然生态环境的质量提供了重要保障。
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关键词喀斯特；贵州；白三叶；同一花序；形态多样性
AbstractByobservingtheshapeindexof19wildTrifoliumrepens，wecomparedthemorphologicaldiversityofthesameinflorescenceatdifferentaltitudes.Ourresultsimplythatthemorphologicaldiversityof19wildTrifoliumrepensonthesameinflorescenceatdifferentaltitudeshasamarkedlydifference.Thetotalcoefficientvariationofallaboveindicesobeysthefollowingorder：leafarea>above-groundbiomass>stolonlength>growingpoint>height>leaflength>leafwidth>growthhabit>Vshapestripe.BetweendifferentaltitudesinTrifoliumrepensformshapeinthegrouphavedifferencedegreesofvariations.Theclusteringanalysisfoundlittlecorrelationwiththealtitudeorigin.
KeywordsKarstregion；Guizhou；Trifoliumrepens；thesameinflorescence；morphologicaldiversity
基因漂移、遗传漂变、遗传瓶颈、自然选择和地方适应性等因素，可以通过在不同时空尺度上的动态变化来影响并改变生物适应性和多样化的进程[1].目前，花粉污染、基因漂移等问题已经在实验中得到普遍证实，而大部分研究只是针对一些基础性工作，如花粉传播因素、基因漂移距离、杂交亲和性等[2-5].空间分离群体之间的隔离和基因流动的程度决定了遗传差异、生殖隔离和物种形成的潜在能力.遗传漂变和自然选择都会使群体之间的差异增加，而基因流的作用会使群体之间的差异减小[5].研究同一花序水平上植物形态多样性，可以减少以上因素的影响，使其表型性状与其生态适应性的研究更趋于一致.
白三叶（TrifoliumrepensL.）是多年生草本优质牧草，属异化授粉植物，广泛分布于世界各地，在农牧业中地位重要.贵州是中国发育最典型的喀斯特地貌之一，不仅地势起伏大、切割强、相对高度常达到300～700m，且喀斯特广泛发育，地貌类型较复杂.其次，贵州具有高原峡谷地貌结构特征，导致水土资源分布不平衡，形成了多种特殊的生态位.白三叶在长期的演化过程中，不断向着适应其生境的方向进化.本研究收集贵州省境内19份白三叶种质为试验材料，比较其不同海拔高度居群间和同一花序水平上的多样性，为下一步选育优质高效白三叶新品种提供指导.
1.1贵州地理与气候
试验在贵州贵阳市贵州牧草推广站温室大棚内进行，种子收集于贵州省不同海拔区域.贵州全省大部分地区气候温和，四季分明.全省平均气温的最高值出现在7月，平均22～25℃；最低值出现在1月，平均为4～6℃；年平均气温为14～19℃.全年极端最高气温为34.0～36.0℃，极端最低气温为-6.0～-9.0℃.常年雨量充沛，时空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地区为1100～1300mm，最大值接近1600mm，最小值约为850mm.一年中的大多数雨量集中在夏季.全省大部分地区年日照1200～1600h，气候特点是垂直方向差异较大，立体气候明显.
1.2材料收集
2013年5～8月在全省范围内采集野生白三叶种子，有效样本19份，见表1.
1.3栽培与观测
1.3.1温室栽培2014年9月20日在贵州省牧草推广站温室大棚播种.从19份材料中各选取一个果实饱满的花序，将来自同一花序的种子播入有32个小格的育苗培养盘，孔穴大小60mm×60mm.每小格播2粒种子，覆土1cm，浇水.培养基质为m（石英砂）∶m（细土）∶m（腐殖质）=3∶4∶3混合而成，高压灭菌冷却后装盘.待长出小苗后留选长势较好的一株苗用于观察研究.
1.3.2施肥和管理每隔3个月施复合肥1次，每次施用量0.03kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012kg/m2，及时除杂草，适时浇水.
1.3.3测量指标2015年5月1日，参照《牧草种质资源描述规范和数据标准》[6]及前人研究方法观测V型斑纹、叶面积、株高、中叶宽、中叶长、匍匐茎长度、生长点个数及地上生物量等指标.为便于分析，将非量化性状特征进行标准化赋值.海拔：1=1000m以下，2=1000～1500m，3=1500～2000m，4=2000m以上；有无V型斑：有斑=1，无斑=2；生长习性：1=直立生长，2=匍匐分枝生长，3=匍匐不分枝生长.
2.1白三叶形态学分析
2.1.2不同海拔高度白三叶形态学数量性状分析不同海拔区域白三叶形态形状居群间存在显著差异，见表3.总体上，随着海拔的提升，白三叶植株越来越高，生长点数越来越多，地上生物量也越来越大；而匍匐茎长度、中叶宽、中叶长和中叶面积则随着海拔的提升而增大，高于2000m的区域则有所减小.在低于1000m的区域，匍匐茎长度的变异系数最大，高达102.87%，其次是地上生物量、中叶面积，最小的是中叶宽，仅为25.49%.在1000～1500m区域，变异范围为21.43%～80.46%，最大的为匍匐茎长度，其次是地上生物量、生长点个数、中叶面积，最小的是中叶宽.在1500～2000m区域，变异范围是21.29%～49.62%，其中变异最大的为地上生物量，其次是中叶面积，中叶宽变异最小.在大于2000m的区域，匍匐茎长度的变异系数最大，为61.37%，其次是地上生物量、中叶面积、株高，最小为中叶长，仅为23.21%.
2.3基于白三叶形态性状的聚类分析
根据贵州野生白三叶的形态鉴定数据进行聚类分析，在欧氏距离为14.5截距处，可将19份白三叶划分为3个聚类（图1），3个聚类性状平均值见表5.第Ⅰ类包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积和生长点数的平均值最小，只有少数无“V”形斑点；第Ⅱ类包括10份材料，其生长点数最多，其余性状指标的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ类之间，少数无“V”形斑点，大多是匍匐分枝生长；第Ⅲ类只有材料7（汇川区董公市镇，987m）独自成一类，除匍匐茎长度最短外，生长点数介于第Ⅰ、Ⅱ类之间，全部有“V”形斑点，均匍匐分枝生长，其余形状指标的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ类.由此可知，聚类分组与海拔高度没有明显的关系.
3讨论与结论
3.1岩溶地区不同海拔野生白三叶同一花序形态多样性
3.2岩溶地区同一花序野生白三叶的多样性与育种
在育种工作中，借助部分表型性状及其组合，可实现对白三叶目标性状的有效选择.本研究中不同海拔区域甚至同一花序白三叶栽培群体内都存在较丰富的遗传变异，可塑性较大，可为优良类型的选择提供材料.目前，对白三叶形态农艺性状已有较多研究，但主要集中在居群间和居群内水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究还未见报道.目前分子生物学技术已成为植物育种研究的有效工具，如李润芳[14]运用细胞学方法和SRAP分子标记技术对8种三叶草的种质资源遗传多样性进行了初步评价，张婧源[15]对来自30个国家的70份野生白三叶从表型性状、SRAP分子标记和SSR分子标记上进行了不同产地白三叶种质资源遗传多样性研究.在花序水平上研究其形态多样性，通过人工选育成的优良品种经济性状整齐、遗传基因稳定.因此，对白三叶进行优良品种选育，最终建立良种繁育体系成为获得质量稳定、可控优质白三叶的必经之路.
3.3岩溶地区贵州野生白三叶的利用价值和开发前景
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