传统酱油以大豆或豆粕为底物在米曲霉的作用下经制曲和盐水发酵两个阶段自然发酵而成。但发酵底物局限性限制了酱油品质的提升。近年来，作为氮源或碳源的酵母抽提物、玉米浆、植物茎叶以及无机盐通常被添加到发酵的底物中以提高种曲和自然发酵菌群的活性，达到改善酱油发酵微生态并促进特征风味形成的目的[1]。而蘑菇本身是一种富含氨基酸、多糖、碳水化合物、粗纤维、核苷酸、维生素、脂肪酸和酰胺类物质的保健食材，将其应用到酱油的发酵中可以提高酱油的品质并满足消费者的健康需求。之前研究发现，猴头菇可以促进酱油中的优势菌群从Stenotrophomonas向Bacillus转换，并且酯类、醇类和亚油酸类香气成分被上调[2]。杏鲍菇酱油以杏鲍菇∶面粉为5∶3的质量比例发酵时，酱油颜色红亮，并且菇香浓郁[3]。但不同种类蘑菇酱油的风味特征和关键香气成分的代谢菌群溯源未被探究。
大豆、炒小麦粉，湖北安琪酵母股份有限公司；猴头菇、滑子菇、草菇、双孢菇、杏鲍菇、姬松茸、鸡腿菇、茶树菇、香菇，哈尔滨北大荒商贸集团控股公司；米曲霉As3.042，天津科技大学菌种室；16SrRNA的V3～V4引物、TruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit，北京诺禾致源科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，贵州天根生物有限公司；C6～C33正构烷烃混合物标准品(≥97%)，美国Sigma-Aldrich公司。
IlluminaNovaSeq6000高通量测序仪，上海鲸舟基因科技有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；7890AGC气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司；Rtx-5色谱柱，上海圣宾仪器科技有限公司；手动顶空固相微萃取进样器、固定搭载装置及固相微萃取头(50/30μmDVB/CAR)，美国Supelco公司。
1.3.1蘑菇酱油的发酵
将浸泡6h的120g大豆与120g炒小麦粉和26.7g鲜蘑菇粉混匀浸润，121℃、0.1MPa灭菌20min。冷却至35℃后，接入质量比0.3%的种曲，混匀后于30℃恒温培养箱培养。大曲出现白色菌丝时进行第一次翻曲，表面呈淡黄色时第二次翻曲，培养至大曲黄绿色时收曲。向成熟的大曲拌入曲料质量2倍的180g/L的盐水，装入发酵罐进行升温式开放发酵。初始发酵温度16℃，每天升高1℃，升温至30℃时进入恒温发酵阶段，发酵周期为180d，并每天进行搅拌[2]。以传统大豆酱油作为对照组，将浸泡6h的140g大豆与120g炒小麦粉搅拌均匀，发酵流程同实验组。从发酵起始每隔30d取样1次，并对所有发酵阶段样品混样处理，实验组、对照组每组样品取3个平行备用。
1.3.2蘑菇的营养成分测定
水分测定参照GB5009.3—2016《食品中水分的测定》；总灰分测定参照GB5009.4—2016《食品中灰分的测定》；粗蛋白测定参照GB5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》；粗脂肪测定参照GB5009.6—2016《食品中脂肪的测定》；粗纤维测定参照GB/T5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》；氨基酸测定参照GB/T5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》。
1.3.3细菌群落高通量测序
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取发酵酱油细菌DNA，以质控和稀释后的总的酱油细菌菌群DNA为模板(1ng/μL)，扩增16SrRNA的V3～V4区域。其引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反应体系(50μL)：10×buffer5μL，三磷酸脱氧核糖核苷1μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(50U/μL)0.5μL，DNA模板100ng，超纯水40μL。PCR扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s，28个循环；72℃，90s；72℃，10min。将PCR产物以2%的琼脂糖凝胶电泳进行混样和纯化。回收的产物以TruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit试剂盒构建文库，并使用NovaSeq6000进行上机测序。
1.3.4生物信息学分析
1.3.5挥发性成分检测
固相微萃取条件：选用50/30μmDVB/CAR萃取头，在20mL顶空瓶中加入4mL发酵样品和1.5gNaCl，60℃预热20min，插入萃取头，萃取吸附20min，GC解吸5min(250℃)。
色谱条件：色谱柱为Rtx-5色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)。升温程序：35℃保持4min，以5℃/min的速度升温至150℃，恒温保持4min，然后以3℃/min的速度升温至220℃，保持5min。载气He，流速1.0mL/min，不分流进样。
质谱条件：EI离子源，电子能量70eV，离子源温度230℃，质量扫描范围m/z35～500u。
利用保留指数(retentionindex,RI)，并结合NIST14谱库检索进行定性分析。将C6～C30正构烷烃混合物单独进样，进样量1μL，升温程序和GC-MS检测条件一致。保留指数计算如公式(1)所示：
(1)
从表1可知，每种新鲜蘑菇的含水量都在90g/100g以上；总灰分含量最低的是双孢菇(8.12g/100g)，最高的是杏鲍菇(14.25g/100g)。新鲜蘑菇中蛋白质的含量占约3%，双孢菇含有最高量的粗蛋白，猴头菇和草菇其次，在植物中属于蛋白质含量比较高的食品。蘑菇作为低脂肪食品，其粗脂肪含量仅占1%左右。蘑菇中供能的单糖、双糖、淀粉类糖含量少，但含有比例较高的功能性多糖和膳食纤维。多糖是蘑菇的重要功能性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抑菌等生理活性。猴头菇较高的多糖含量(4.21g/100g)可能更加利于发酵益生菌的利用。
表1蘑菇中的营养成分单位：g/100g
Table1Nutrientsinmushrooms
注：以可食用部分计(下同)
表2蘑菇中呈鲜味氨基酸的含量Table2Contentofumamiaminoacidsinmushrooms
分别以香农和Chao1指数表征蘑菇酱油的多样性和丰富度(图1-a)。与大豆酱油相比，猴头菇酱油中细菌的多样性和丰富度显著降低(P<0.05)。因为猴头菇本身特有的cyathane型二萜类次级代谢产物，如猴头菇素C和猴头菇素P，具有强烈的抗菌活性[9]。与之相反的是，香菇酱油中细菌的多样性和丰富度显著高于对照(P<0.05)。香菇所携带的原始菌群，有助于有机质的降解和菌丝的生长，这为其他细菌提供了营养活性物质[10]。其他蘑菇酱油的多样性和丰富度与大豆酱油相比都出现了一定的变化(P>0.05)。蘑菇的添加为酱油发酵提供了丰富的菌体蛋白和蘑菇多糖，这诱导蘑菇酱油和传统大豆酱油的菌群出现偏移。
a-多样性差异；b-组成差异图1蘑菇酱油细菌的多样性和组成差异Fig.1Diversityandcompositiondifferenceofbacteriainmushroomsoysauce
细菌群落结构的主坐标分析验证了蘑菇酱油的菌群特点(图1-b)。与多样性和丰富度的分析结果一致，猴头菇酱油的细菌群落是与其它酱油分离的。基于猴头菇的抗菌性，可能形成了某一优势且单一的菌群，并主导了酱油的发酵。其次，草菇、茶树菇和姬松茸酱油的发酵菌群各不相同，这是蘑菇酱油风味多样化的前提。而鸡腿菇、杏鲍菇、双孢菇和滑子菇酱油的细菌群落在主坐标PC1(68.02%)上与大豆酱油是相似的，这些蘑菇对细菌群落的干预性较低。香菇虽然显著提高了细菌的多样性和丰富度，但香菇酱油的菌群结构依旧与大豆酱油类似。这意味着香菇虽然促进了菌群的繁殖，但这些菌群并不是酱油的核心发酵菌群。
a-核心菌属；b-生物标记图2蘑菇酱油的核心菌属和生物标记Fig.2Corebacteriaandbiomarkersofmushroomsoysauce
各种蘑菇酱油间浓度差异显著的风味成分如图3所示。与大豆酱油相比，蘑菇酱油主要上调了酯类和醇类香气组分。蘑菇酱油中的酯类物质，如苯乙酸乙酯、油酸乙酯、α-戊基-γ-丁内酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯和安息香酸乙酯普遍升高，因此蘑菇酱油具有更浓郁的果香和花香风味。特别的，只有双孢菇和杏鲍菇酱油检测到了亚麻酸乙酯(酯香)。而丰富的亚油酸乙酯为茶树菇提供了酯香的同时，也赋予茶树菇酱油抗动脉粥样硬化的保健功能。而具有蜡香和奶油香气的十六碳酸乙酯是双孢菇和茶树菇酱油的特征风味成分。
图3蘑菇酱油的特征风味成分Fig.3Characteristicflavorcomponentsofmushroomsoysauce
对于醇类香气，2-甲基-1-丁醇、蘑菇醇和异丁醇是蘑菇酱油普遍上调的风味物质。而具有玫瑰花香的苯乙醇是蘑菇酱油上调最显著的风味成分，特别是在杏鲍菇酱油中。异戊醇具有苹果和白兰地的香气，这是草菇酱油的特征香气。2,3丁二醇和乙醇分别在滑子菇和香菇酱油中显著提升，这为酱油增添了醇香。特别是与大豆酱油相比，乙醇在香菇酱油中提高了31.82倍。
此外，蘑菇的添加对酮、醛、酸和吡嗪类特征风味物质形成的干预性较小。蘑菇酱油对具有风信子香气的苯乙醛和焦糖味的异戊醛的生成具有普遍的促进作用。有趣的是，添加蘑菇发酵将剥夺酱油中具有橙子香气的D-柠檬烯成分，这可能是因为微生物的发酵作用将烯烃类成分氧化成了酯类。