主管：中华人民共和国教育部主办：四川大学华西医学中心四川大学华西医院主编：刘春涛林江涛刊期：月刊ISSN：1671-6205CN：51-1631/R
目的以博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的肺纤维化小鼠为模型，探讨4-苯基丁酸（4-phenylbutyricacid，4-PBA）在肺纤维化中的作用及其机制。方法C57BL/6小鼠气管内注射BLM建立小鼠肺纤维化模型。将120只小鼠随机分为三组：BLM组、BLM+4-PBA组和对照组。对小鼠肺组织进行病理分析，比较小鼠存活率，检测内质网应激标志物感受器活化转录因子6（activatingtranscriptionfactor6，ATF6）和C/EBP同源蛋白（C/EBPhomologousprotein，CHOP）在小鼠肺组织中的表达水平。结果BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中胶原沉积明显，给予4-PBA后减轻了肺组织胶原沉积。与BLM组相比，在肺纤维化形成期维持2周的4-PBA治疗可明显改善小鼠肺功能，提高生存率。同时，4-PBA治疗显著降低了小鼠肺组织中ATF6和CHOP的mRNA及蛋白表达水平。结论4-PBA可抑制内质网应激，从而减轻BLM诱导的小鼠肺纤维化。
引用本文：杨赟,杨宠玉,王亚丽,崔德月,毕辉,何骞,葛运起,李志英,张秋娣,邱慧,周军.4-苯基丁酸对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用及机制探讨.中国呼吸与危重监护杂志,2022,21(11):797-803.doi:10.7507/1671-6205.202208018复制
120只无特定病原体级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，20～22g（上海斯莱克实验动物有限公司），戊巴比妥钠（上海博光生物科技有限公司），BLM（日本NipponKayaku公司），羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），RNA提取试剂盒（美国BIOMIGA公司），ReverTraAceqPCRRTKit试剂盒（日本TOYOBO公司），合成引物（上海生工公司），ThunderbirdSYBRqPCRMixKit（日本TOYOBO公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量检测试剂盒（中国威奥生物科技公司），放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitationassay，RIPA）裂解液（上海索莱宝生物科技有限公司），十二烷基硫酸钠聚丙凝胶配置试剂盒（中国威奥生物科技公司），牛血清白蛋白（albuminfrombovineserum，BSA，美国Sigma公司），ATF6抗体（美国Abcam公司），CHOP抗体（美国CellSignaling公司），β-肌动蛋白（β-actin）抗体（上海普迈生物科技有限公司），辣根过氧化物酶二抗（中国华安生物科技有限公司），微孔板分光光度计Epoch2（美国BioTek有限公司），ABI-7500荧光定量PCR反应扩增仪（美国ABI公司），Bio-Rad凝胶成像系统（美国Rio-Rad公司），小鼠肺功能检测仪（美国DSIBuxco公司）。
雄性C57BL/6小鼠购买后在12h明暗光照循环，温度22～24℃和相对湿度50%～60%的环境中饲养，小鼠自由饮水和正常饮食。小鼠适应性饲养1周以后，随机分为BLM组、BLM+4-PBA组和对照组，每组40只小鼠。动物实验由苏州大学实验动物管理和使用委员会批准（批准号K18-028）。
羟脯氨酸是胶原蛋白的标志性成分，为胶原纤维所特有。检测羟脯氨酸来判断肺纤维化程度。使用羟脯氨酸碱水解法试剂盒，按照说明书步骤操作，通过测定样本水解液550nm处吸光值，按照标准公式计算出小鼠肺组织羟脯氨酸的含量。
在实验的第21和28天，各组随机选择6只小鼠肺组织，使用RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA，使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度。使用ReverTraAceqPCRRTKit试剂盒将RNA逆转录为cDNA。将制备好的cDNA作为模版，根据引物（ATF6F：5′-CGGTCCACAGACTCGTGTTC-3′，R：5′-GCTGTCGCCATATAAGGAAAGG-3′；CHOPF：5′-CTGGAAGCCTGGTATGAGGAT-3′，R：5′-CAGGGTCAAGAGTAGTGAAGGT-3′；β-actinF：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，R：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′）按照PCR反应条件，用ABI-7500荧光定量PCR进行RealtimePCR扩增。以β-actin为内参，用2△△Ct计算肺组织中ATF6和CHOP的mRNA相对表达水平。
在实验的第21和28天，各组随机选择6只小鼠肺组织，使用RIPA裂解液提取肺组织全蛋白，用BCA蛋白定量检测试剂盒定量检测蛋白浓度。取15～20μg蛋白进行电泳和电转。用5%BSA封闭蛋白后，4℃孵育一抗ATF6抗体（1∶1000）、CHOP抗体（1∶1000）和β-actin抗体（1∶2000）过夜。次日，用含Tween20的Tris缓冲液（TBSwithTween-20，TBST）洗脱后加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000），在室温下孵育1h，TBST洗脱后，使用化学发光法检测蛋白表达，Bio-Rad凝胶成像系统扫描蛋白印记条带，对蛋白表达情况进行定量分析。
a、d.对照组肺泡结构正常，无明显病理改变；b、e.BLM组肺泡间隔增宽、炎症细胞浸润、肺组织结构破坏及胶原纤维沉积；c、f.BLM+4-PBA组肺泡间隔增宽、炎症细胞浸润、肺组织结构破坏及胶原纤维沉积较BLM组减轻；g.肺组织急性肺损伤评分（n=10）。*P<0.01。
a、d.对照组未见明显蓝色胶原沉积；b、e.BLM组肺泡间隔增宽、蓝色胶原沉积明显；c、f.BLM+4-PBA组肺泡间隔增宽、蓝色胶原沉积较BLM组减轻；f.肺组织纤维化评分（n=10）；g.肺纤维化得分。*P<0.01。
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a.FVC（n=5）；b.FEV50（n=5）；c.小鼠Cdyn（n=5）。与BLM组比较，*P<0.05；**P<0.01；n.s.差异无统计学意义。
总之，内质网应激是一种普适性的保护机制，本研究表明4-PBA通过抑制内质网应激有效地保护了BLM诱导的小鼠肺纤维化，这一发现可能为IPF的治疗提供新的干预靶点。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
表1小鼠肺组织羟脯氨酸含量（μg/g，n=5，）
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引用本文：杨赟,杨宠玉,王亚丽,崔德月,毕辉,何骞,葛运起,李志英,张秋娣,邱慧,周军.4-苯基丁酸对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用及机制探讨.中国呼吸与危重监护杂志,2022,21(11):797-803.doi:10.7507/1671-6205.202208018