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MitoBrightLTGreen试剂货号：MT10
特点：
●可在含血清培养基中染色
●荧光显微镜、流式细胞仪均可检测
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产品概述
产品特点
用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBrightLT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBrightLT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。
＜检测条件＞
MitoBrightLTGreen、（T公司）Green：Ex488nm/Em500–560nm
MitoBrightLTRed、（T公司）Red：Ex561nm/Em560–620nm
MitoBrightLTDeepRed、（T公司）DeepRed：Ex640nm/Em650–700nm
2.可以使用含血清培养基
用MitoBrightLT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBrightLT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。
实验例
实时荧光观察
<检测条件>
设备：LSM-700Laserscanningconfocalmicroscope(LSCM)
(CarlZeiss,Oberkochen,Germany)
激发波长：
MitoBrightLTGreen488nm
MtphagyDye555nm
物镜：63x
拍摄间隔：15秒
用流式细胞仪检测
1.用RPMI培养基(10%FetalBovineSerum,1%Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×105cell/ml)接种于5cm培养皿中，在37℃，5%CO2培养箱内过夜培养。
2.去除培养基，加入MitoBrightLTWorkingSolution(0.1μmol/l,5ml)，在37℃培养30分钟。
3.去除溶液，用5ml的PRPMI培养基清洗细胞2次。
4.更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2天用流式细胞仪检测。
MitoBrightLTGreenMitoBrightLTRedMitoBrightLTDeepRed
Excitation:488nmExcitation:488nmExcitation:633nm
Emission:515-545nmEmission:564-604nmEmission:650-670nm
在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像
胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。
现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBrightLT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。
<染色条件>
将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。
加入100nmol/l的MitoBrightLTGreen工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。
Ex488nm，Em500-560nm
<结果>
现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBrightLT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。
通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造
线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-DeepRed染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。
＜实验条件＞
色素：MitoBrightLTDeepRed（100nmol/l）
仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCSSP8STED3X
Ex.640nm/Em.650-700nm
STED激光：775nm
<实验步骤>
1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5%CO2）。
2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLTDeepRed（100nmol/l）工作液。
3孵育45分钟（37度，5%CO2）。
4去除上清液，用HBSS清洗两次。
5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（LeicaTCSSP8STED）进行观察。
以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。
产品文献
荧光特性
MitoBrightLT染料的荧光特性
常见问题Q&A
Q3：用MitoBrightLT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBrightLT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。
HeLa细胞用MitoBrightLT（100μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。
用FCCP（100μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。
MitoBrightLTGreen:Ex488nm/Em500–560nm
MitoBrightLTRed:Ex561nm/Em560–620nm
MitoBrightLTDeepRed:Ex640nm/Em650–700nm
规格性状
性状：本品是黄色液体
吸光度：0.600～0.800(490nm附近）
●标记稳定性强、特异性高
●可用于免疫荧光共染色
近年来，随着显微镜技术的发展，有关细胞器的研究正在由原来的“单独研究线粒体的机能””逐渐向“线粒体与其他细胞器之间的相互作用”的方向转移。因此，对于线粒体的更详细的形态观察需求越来越大。
MitoBrightIMRed克服了其他染料的靶向标记稳定性差的问题，是一种可以用于免疫荧光共染色线粒体荧光探针。
实验例：与内质网标记物KDEL的共染色
用MitoBrightIMRed标记HeLa细胞的线粒体，经固定化和膜透性处理后再用内质网标记物KDEL的抗体进行免疫共染色。并且在左图的箭头所示范围内进行了荧光强度的检测。从荧光图像可以清晰的观察线粒体与附近的内质网的形态。
MitoBrightIMRed(红)Ex:561nm,Em:560-620nm
KDEL抗体-Alexa488(绿)Ex:488nm,Em=490-550nm
Scalebar:10μm
MitoBrightIMRed与其他试剂的不同
传统的小分子荧光染料在染色后的固定化操作或透膜剂处理后，往往会失去靶向性。而MitoBrightIMRed与其他染料相比，提高了靶向稳定性，可以抑制免疫荧光实验时固定化操作造成的荧光强度减弱等问题。
荧光强度差的比较
MitoBrightIM与(T公司的)传统荧光染料相比，在活细胞线粒体染色后的固定化处理和透膜剂处理后的荧光强度如下图所示。固定化处理和透膜剂处理后，荧光强度都有一定的下降，但是MitoBrightIM比传统染料的靶向标记稳定性更高，因此可以观察到更清晰的线粒体染色情况。
Ex=561nm;Em=560-620nm
荧光背景的比较
使用线粒体标记物TOM20抗体比较MitoBrightIM和传统试剂的免疫染色后的线粒体定位情况。用MitoBrightIM和传统试剂对HeLa细胞进行染色，然后用TOM20抗体进行二抗免疫荧光染色。结果显示，用MitoBrightIM或现有试剂对HeLa细胞进行染色，然后用TOM20抗体进行二抗染色。结果显示，传统试剂有扩散到线粒体以外区域的情况，导致背景很高，而MitoBrightIM的背景更低，而且定位与TOM20抗体一致。
Ex=561nm;Em=560-620n
与传统试剂的对比
可检测的次数
规格荧光显微镜（35mmdish,workingsolution2ml/dish时)20μl10枚20μlx330枚
激发波长(λex)：548nm发射波长(λem)：566nm
(参考实验)
分别采用“先FCCP刺激后染色”和“先染色后FCCP刺激”的方法对HeLa细胞进行实验并观察荧光。
先进行MitoBrightIM染色再FCCP刺激的实验组很顺利的观察到了荧光，而相反的实验组没有观察到荧光。
●高水溶性
●膜渗透性好
性质
氯离子通过细胞膜的运输，涉及很多细胞方面的生理功能，并且是生物学上非常重要的研究课题。此处介绍的MQAE是一种高灵敏度的荧光试剂，其荧光强度会被Cl-降低。MQAE对Cl-的消光系数约为SPQ的两倍，并且Cl-对浓度变化的敏感性也优于SPQ。MQAE的荧光波长为λex=355nm和λem=460nm，荧光强度与SPQ相似，可检测的Cl离子浓度为0至50mmol/l。
此外，MQAE具有高水溶性和膜通透性，可以很容易地引入到细胞膜中。MQAE的荧光强度不受其他体内阴离子，pH等的影响，[Cl-]的变化可通过荧光强度进行跟踪。
溶解例
3mg/mL（水：乙腈=1：1）
参考文献
性状：本品为淡黄色至黄色粉末。
纯度（HPLC）：95.0％或更高
红外光谱：测试合格
处理条件
1.保存方法：冷藏
DTSSP试剂D630交联剂
蛋白抗体标记
品名货号用途
代谢
各项代谢指标完全解读
糖酵解氧化磷酸化代谢关联指标
脂质代谢关联指标
氨基酸代谢关联指标
细胞代谢与疾病
癌症
癌细胞在无限增殖的同时保持着活跃的细胞代谢，不断吸收大量的营养物质进行蛋白质、核酸、能量（如ATP）的合成。即使在不利的环境下(低氧气、低营养)，癌细胞仍然可以通过改变代谢途径而存活下来。近年来，针对癌细胞的代谢途径的研究也越来越多。
*请注意，上述内容是概括性的癌细胞代谢特征的描述。随着癌细胞种类的不同和环境的变化会有一定差别。
下面是一些癌细胞代谢的综述性文献，供初次接触这一领域的研究人员参考。
1)糖酵解：M.G.VanderHeiden,L.C.Cantley,andC.B.Thompson,“UnderstandingtheWarburgEffect:TheMetabolicRequirementsofCellProliferation”,Science,2009,324,1029.
2)氨基酸代谢、ROS：P.Koppula,Y.Zhang,andB.Gan,“AminoAcidTransporterSLC7A11/xCTattheCrossroadsofRegulatingRedoxHomeostasisandNutrientDependencyofCancer”,CancerCommun.,2018,38,12.
3)氨基酸代谢：E.L.Lieu,T.Nguyen,S.Rhyne,andJ.Kim,“AminoAcidsinCancer”,Exp.Mol.Med.,2020,52,15.
4)线粒体、ROS、NADPH：F.CiccareseandV.Ciminale,“EscapingDeath:MitochondrialRedoxHomeostasisinCancerCells”,Front.Oncol.2017,7,117.
5)NADH：A.Chiarugi,C.Dolle,R.Felici,andM.Ziegler,“TheNADMetabolome-AKeyDeterminantofCancerCellBiology”,Nat.Rev.Cancer,2012,12,741.
抑制葡萄糖代谢和抗癌作用
葡萄糖转运蛋白（GLUT）是药物发现中糖酵解靶蛋白的一个例子。由于癌细胞通过葡萄糖转运蛋白摄取大量的糖，因此可以通过直接抑制葡萄糖转运蛋白来抑制糖酵解。另外，抑制葡萄糖饥饿的活性、糖酵解系统的酶(己激酶：HK、乳酸脱氢酶：LDH等)，和抑制糖酵解系统的最终产物乳酸向细胞外的流出也是有效的手段。
各抑制剂引起的细胞内代谢变化.文献
抑制氨基酸代谢与癌症治疗
在增殖活跃的癌细胞中，氨基酸是蛋白质和核酸合成所必需的营养素。由于癌细胞中来自糖酵解系统的乙酰CoA的供给降低，因此积极利用氨基酸
关联产品
抑制脂肪酸代谢和抗癌作用
另一方面，癌细胞利用脂肪酸的β氧化来有效地产生能量，以补充糖酵解系统低效能量的产生。因此，以脂肪酸的β氧化为目标的药剂开发也在进行中。
1)Z.Yin,L.Bai,W.Li,T.Zheng,H.Tian,andJ.Cui,“TargetingTcellmetabolisminthetumormicroenvironment:ananti-cancertherapeuticstratety”,J.Exp.Clin.CancerRes.2019,38,403.
2)L.Almeida,M.Lochner,L.Berod,andT.Sparwasser,“MetabolicpathwaysinTcellactivationandlineardifferentiation”,Semin.Immunol.2016,28(5),514.
3)A.KumarandK.Chamoto,“ImmunemetabolisminPD-1blockage-basedcancerimmunotherapy”,Int.Immunol.,2020Jul5;dxaa046.
4)D.G.Franchina,F.He,andD.Brenner,“Survivalofthefittest:CancerchallengesTcellmetabolism”,CancerLett.,2018,412,216.
5)N.Patsoukis,K.Bardhan,P.Chatterjee,D.Sari,B.Liu,L.N.Bell,E.D.Karoly,G.J.Freeman,V.Petkova,P.Seth,L.Li,andV.A.Boussiotis,“PD-1altersT-cellmetabolicreprogrammingbyinhibitingglycolysisandpromotinglipolysisandfattyacidoxidation”,Nat.Commun.,2015,6,6692.
糖尿病
在高血糖状态下，细胞内葡萄糖浓度升高，多元醇途径代谢增强。这会过度消耗NADPH，减少还原型谷胱甘肽(GSH)。其结果是，氧化应激增加，促进细胞损伤。
M.Brownlee,“Thepathobiologyofdiabeticcomplications:aunifyingmechanism”,DIABETES,2005,54,1615.
衰老
DNA损伤引发的细胞衰老
在衰老的细胞中，由于线粒体功能下降，主要由厌氧的糖酵解通路产生ATP，因此乳酸的产生量增加7）。DNA损伤是细胞衰老导致线粒体功能障碍的原因之一。DNA损伤的积累会激活DNA修复机制并增加NAD+消耗。NAD+量的减少会降低SIRT1活性，这是维持线粒体功能的重要因素，导致线粒体功能的降低（电子转移的抑制→ATP产生/NAD+量的减少）3),8)。
谷氨酰胺代谢和细胞衰老
抑制肿瘤的menin通过靶向依赖mTORC1的代谢激活来预防效应CD8T细胞功能障碍9)。
Menin是一种肿瘤抑制因子，在预防衰老和疲劳等T细胞功能障碍中起着重要作用。当Menin缺乏时，mTORC1被激活，并通过糖酵解系统和谷氨酰胺降解增强氧化磷酸化，导致CD8T细胞功能障碍。此外，谷氨酰胺代谢中间产物α酮戊二酸有助于维持mTORC1激活和促进细胞衰老(SA-β-gal活性增强)。谷氨酰胺-α-酮戊二酸通路在诱导CD8T细胞功能障碍中发挥重要作用，并发现Menin有抑制T细胞衰老的可能性。