背景：星形胶质细胞在肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的选择性运动神经元病理中起着至关重要的作用，但尚未完全阐明。在其他职责中，星形胶质细胞提供重要的神经元稳态支持，然而这种功能在ALS中高度受损。建立完整的人类共培养系统可用于进一步研究功能失调的细胞间相互作用的潜在机制，并有可能为揭示新的治疗切入点提供平台。
结果：观察到星形胶质细胞稳态失调，这导致FUS-ALS介导的炎症细胞因子的反应性和分泌增加。在与运动神经元和肌管共培养后，作者检测到突变的星形胶质细胞对运动神经元-神经突生长、NMJ形成和功能的细胞毒性作用，这些作用通过同基因对照星形胶质细胞得到改善或完全恢复。作者证明ALS星形胶质细胞具有涉及WNT/β-连环蛋白通路的毒性获得和失去支持功能，最终导致运动神经元稳态、细胞间网络和NMJ的破坏。
结论：本文研究揭示了星形胶质细胞在ALS中复杂而又非常重要的作用，并为其病理机制提供了进一步的见解。
研究背景：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种进行性运动神经元疾病，其中运动皮层的上运动神经元以及脑干和脊髓腹角的下运动神经元发生选择性和进行性细胞死亡，症状包括肌无力、痉挛、反射亢进、肌束震颤和肌肉萎缩。疾病进展快速，症状出现后的中位生存期为2-5年，主要是由于呼吸衰竭，目前无有效的治疗方法。在90%的病例中，ALS是一种散发性疾病(sALS)，临床上与遗传性家族性疾病难以区分，但病因不明。其余10%为家族性ALS(fALS)病例，其中FUSRNA结合蛋白(FUS)基因突变是西方世界第四大fALS病因(2.8%)，也是亚洲ALS人群中第二常见的病因(6.4%)。此外，FUS突变导致了大多数青少年和儿童ALS病例。有趣的是，FUS蛋白的细胞核到细胞质错定位是FUS突变的病理学标志，在sALS病例中有记载，尽管FUS基因缺乏基因突变，但约10%的额颞叶变性(FTLD)病例中存在FUS阳性包涵体，这表明FUS介导的病理学可能在神经退行性疾病中具有更普遍的功能。
在这项研究中，本文作者旨在揭示hiPSC衍生的星形胶质细胞在FUS-ALS背景下的作用，并将这些细胞纳入作者之前建立的人类运动单元微流体模型，以评估星形胶质细胞在新型多细胞系统中的作用。作者发现FUS-ALS星形胶质细胞显示出增加的反应性和炎症细胞因子的分泌。一旦纳入运动单元系统，突变的星形胶质细胞就会损害神经突的生长以及NMJ的形成和功能。作者的数据发现了突变的fFUS介导的星形胶质细胞失调，这导致协同的毒性获得和支持功能丧失。作者提出了一种自动调节作用，其中星形胶质细胞试图通过分泌抗炎细胞因子和上调运动神经元中WNT/β-连环蛋白通路来抵消这种毒性，但没有成功。
结果：
1.hiPSCs分化为独立于FUS突变的功能性星形胶质细胞
A.星形胶质细胞分化方案概述。hiPSC在第0天（d0）分离，在诱导阶段作为胚状体（EBs）培养，然后在第7天（d7）接种它们以形成神经花环结构。到第16天（d16），神经花环结构经过扩增以产生神经祖细胞（NPC）。然后将NPCs分化为星形胶质细胞祖细胞（APCs，d25/d+0）,之后APC在第4周（d28）再成熟为星形胶质细胞。
B.成熟第4周（d28）星形胶质细胞的代表性共聚焦图像，除神经元标记物MAP2外，还用星形胶质细胞标记物S100β、AQP4、ALDH1L1和SOX9染色，细胞核用DAPI染色。（比例尺：75um）
C.星形胶质细胞核神经元标记物阳性细胞的定量。3次生物学重复的均值s.e.m.（n=15张图像）。
D.来自RNAseq实验的4周内细胞类型特异性基因表达热图，在3个生物学重复中进行检测。深蓝色细胞：PRKM100。
E.基于Fluo-4染色的成熟星形胶质细胞（6周内）自发钙瞬变的功能评估。y轴范围:△F/Fo=50%
F.Fluo-4峰值强度的定量。Mann-Whitney检验。****p<0.0001。
G.活性星形胶质细胞的百分比。非活性星形胶质细胞截断值:Fluo-4强度升高<100，非配对t检验，p<0.05。
H.第4周成熟星形胶质细胞中上调(红色)和下调(蓝色)基因的火山图。绿线表示阈值:log2FC<-1.0且-log10(FDR)>2.0被认为是下调，log2FC>1.0且-log10(FDR)>2.0被认为是上调。
I.突变组间差异表达基因的比较。图F和G中的图标显示了3个生物学重复经2-6个技术重复检测的平均值s.e.m。
2.FUS-ALS星形胶质细胞表现出增加的反应性
图2FUS-ALS星形胶质细胞表现出增加的反应性。
A.4周成熟星形胶质细胞中GFAP表达的共聚焦图像。用DAPI染色细胞核。比例尺:75um。
B.GFAP表达定量。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。3次生物学重复的均值±s.e.m.(n=15张图像)p<0.0001。
C.FUS蛋白在4周成熟的P525L和P525P星形细胞中定位的代表性共聚焦图像。用DAPI染色细胞核。比例尺:50um。插入比例尺:10um。
D.GFAP+和AQP4+星形胶质细胞中FUS细胞质错定位的小提琴图。来自3个生物重复数据(n=60张图像)。分别为未配对t检验和Mann-Whitney检验。**p<0.05和****p<0.0001。
E.第4周的凋亡评估：用cleavedcaspase3染色染色成熟星形细胞。小提琴图来自3个生物重复(n=30张图像)，去除异常值(Q=0.1%)。
F.未成熟(d25/d+0)和更成熟(第4周)星形胶质细胞分泌组分析。3个生物学重复均值±s.e.m。
G.第4周成熟星形胶质细胞RNAseq反应性星形胶质细胞基因表达谱。
神经胶质原纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidprotein,GFAP)是一种广泛使用的星形胶质细胞标志物，但也指示星形胶质细胞的反应性。由于有报道ALS患者尸检样本中GFAP表达增加，因此作者使用ICC研究了星形胶质细胞群中GFAP的表达。分析显示，在所有hiPSC细胞系的星形胶质细胞成熟过程中GFAP逐渐增加（图3A-B），然而特别的是，P525L突变星形胶质细胞GFAP阳性细胞百分比明显更高(图2A-B)。Westernblot(WB)实验证实了这些发现，以及qPCR分析也显示GFAP基因表达的成熟依赖性增加。
正如作者之前在FUS-ALS患者成纤维细胞、hiPSCs和hipsc衍生的运动神经元中证明FUS蛋白的细胞质错误定位一样，作者还评估了FUS蛋白在星形胶质细胞中的细胞定位。与这些发现一致，两种FUS突变细胞系在GFAP阳性的星形胶质细胞群中都显示出FUS的细胞质错误定位，而在更普遍的AQP4阳性群体中，只有P525L星形胶质细胞表现出错误定位(图2-C和D)。通过cleavedcaspase3ICC点的大小测量细胞凋亡无明显差异（图2-E）。
由于到目前为止，作者的数据支持FUS-ALS星形胶质细胞的毒性反应表型，因此作者将反应性星形胶质细胞分为两类：“A1”星形胶质细胞具有神经毒性，“A2”星形胶质细胞具有神经保护作用。与对照组相比，研究结果显示，FUS突变星形胶质细胞中既没有明确的A1或A2基因的表达谱，但显示每组内的基因及泛反应性星形胶质细胞中存在的基因都由上调和下调(图2-G)。综上所述，这些结果证明了FUS突变介导的星形胶质细胞反应性，以一种毒性的、异质突变依赖的方式影响转录组和分泌组。
3.hiPSC衍生的星形胶质细胞成功地集成在人体运动单元的微流体模型中
图3运动神经元和肌管验证建立微流控共培养模型。
A.运动神经元从hiPSC分化通过EB状态向MN-NPC以及最终向有丝分裂后脊髓运动神经元分化的概述。
B.分化第28天成熟运动神经元的代表性共聚焦图像，除泛神经元标记物NEFH和微管蛋白(Tubulin)外，还用运动神经元标记物ChAT和胰岛1（Islet-1）染色。细胞核用DAPI染色。比例尺:25μm。
C.神经元标记物阳性细胞数量的定量。3次生物学重复均值±s.e.m(n=15张图像)。Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。
D.肌管分化概述。从股外侧肌中分离出原代人成肌细胞，扩增分化为多核细长肌管。
E.用标记物(AB+)MyoG,MyHC,desmin,titin和ACTN2染色的肌管的代表性共聚焦图像。用DAPI染色的细胞核，比例尺:200um。
F.多核肌管中肌源性标志物的定量。3次生物学重复的均值±s.e.m.(n=15张图像)。
4.FUS-ALS星形胶质细胞无法整合到运动神经元网络中
图4FUS-ALS星形胶质细胞无法整合到运动神经元网络中。
A.hiPSC衍生的运动神经元(MN)和星形胶质细胞(AC)共培养设置概述。
B.共培养1周和2周后，在微流控装置突出显示的运动神经元/星形胶质细胞室进行实验评估。
C.1周后微流控装置运动神经元和星形胶质细胞共培养的扫描电镜图像。突变的星形胶质细胞用白色虚线圈起来。比例尺:10um。
D.成熟第4周时，突变型星形胶质细胞中与对照组相比前25种RNAseq典型通路。分析采用的截断值为对数比-1.0到1.0,FDR为0.001。虚线标记p值=0.05。
为了进一步评估FUS-ALS星形细胞功能的机制，作者对RNAseq数据进行了IPA经典通路分析。大多数通路在FUS-ALS星形胶质细胞中下调，代表了一种失去支持的机制，因为这些通路主要参与了神经元稳态的维持(图4-D)。值得注意的是，在P525L和R521H的前3位分别发现突触发生信号通路和轴突引导信号通路，进一步支持了星形胶质细胞-神经元相互作用的失调。总的来说，作者的数据表明FUS-ALS星形胶质细胞不能整合和支持运动神经元网络。
5.P525LFUSALS星形胶质细胞损害运动神经元的神经突生长
图5P525LFUS-ALS星形胶质细胞损害运动神经元神经突生长。
A.与星形胶质细胞(AC)共培养1周(d28)后，运动神经元(MN)神经突(NEFH/SYP)在肌管室中生长的平片扫描共聚焦图像示例。箭头(右)描绘了微凹槽出口时神经突的生长方向。比例尺:300um。
B.从微槽出口开始，每隔50um对瓦片进行交叉线扫描。C-F.运动神经元、肌管和星形胶质细胞共培养1周(图C+E)和2周(图D+F)后像素交叉点数量的神经元突生长定量。图C-F中的图标显示了3个生物学重复的平均值±s.e.m。采用双因素方差分析和Tukey多重比较检验进行基因型之间的总体比较。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
6.FUS-ALS星形胶质细胞损害NMJs的形成和功能
图6FUS-ALS星形胶质细胞损害NMJ的形成和功能。
A.运动神经元(MN)和星形胶质细胞(AC)共培养1周和2周后，在微流控装置的突出显示的肌管隔室中进行实验评估。
B.NMJ的共聚焦图像示例。通过运动神经元(NEFH)和突触前(SYP)标记物与MyHC染色的肌管上的突触后AChR标记(Btx)之间的共定位来鉴定NMJs。比例尺:20um。
C-F.运动神经元/肌管与星形胶质细胞共培养1周(图C-D)和2周(图E-F)后每个肌管NMJ的数量定量。
I.用于评估NMJ功能的活细胞钙记录示意图概述。用50MmKCl刺激运动神经元/星形胶质细胞室以引起细胞内反应，随后用钙敏感的Fluo-4染料标记的肌管记录钙的内流。
J.KCl刺激后肌管内代表性钙内流曲线(箭头)。
K.Fluo-4峰值强度的量化。删除异常值(Q=1%)。
L.NMJ兴奋性肌管占总活动肌管的百分比。(K和L)中的数据表示每个实验室中4~5个生物学重复和2个技术重复的平均值±s.e.m。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。*p<0.05，**p<0.01。
为了评估NMJ的功能，作者在P525L和P525P条件下进行了活细胞钙记录，如前所述。通过用氯化钾(KCl)化学刺激运动神经元/星形胶质细胞隔室，在Fluo-4标记的肌管中诱发了钙的内流，证实了钙通过功能性NMJ连接传递(图6-I)。在所有条件下都可以记录内流曲线(图6-J)，与完全等基因共培养相比，完全突变系统中的峰值大小减少(图6-K)。同样，在完全突变系统中发现NMJ可兴奋肌管百分比减少(图6-L)，而在P525L运动单元与P525P星形胶质细胞共培养中可以观察到一种修复趋势。无星形胶质细胞的P525P和P525L共培养未观察到明显差异，这表明NMJ形成的差异(图D)可以解释为P525P运动单元系统中存在更多未成熟的非功能性NMJ。此外，这也可以解释在共培养第1周和第2周之间，P525P运动单元中NMJ数量没有变化，因为该系统可能已经达到了NMJ形成的最大潜力(图6-H)。
综上所述，这些结果表明，FUS-ALS，特别是P525L星形胶质细胞会损害运动神经元神经突的生长，NMJ的形成和功能，而IC星形胶质细胞能够挽救许多这些畸变。
7.FUS-ALS星形胶质细胞激活FUS-ALS运动神经元中的WNT/β-连环蛋白通路
图7FUS-ALS星形胶质细胞通过WNT/β-catenin通路影响运动神经元。
A.WNT/β-catenin通路组分在4周成熟星形胶质细胞中的RNAseq差异基因表达。
B.4周成熟的P525L和P525P星形胶质细胞(AQP4)中β-catenin表达的代表性共聚焦图像。插图显示了星形胶质细胞的放大，具有β连环蛋白定位。用DAPI染色的细胞核，比例尺：50um。插入比例尺:5um。
C.β-连环蛋白定位的定量,以细胞核/细胞质比率表示。来自3个生物重复数据(n=30张图像)。非配对t检验。**p<0.01。
D.运动神经元（微管蛋白）中β-连环蛋白表达的代表性共聚焦图像，这些神经元已与星形胶质细胞（GFAP）共培养48小时。插图显示了具有β-连环蛋白定位的运动神经元的放大倍数。箭头显示了β-连环蛋白积累的例子。细胞核（DAPI）用白色虚线圈出。比例尺：50μm。插入比例尺：5μm。
E.每个微管蛋白运动神经元的β-连环蛋白积累次数的量化。
F.微管蛋白运动神经元中单个β-连环蛋白积累大小的定量。
G.微管蛋白运动神经元中不同大小范围的β-连环蛋白积累的百分比分布。
H.微管蛋白*运动神经元胞质面积(um2)胞质b-连环蛋白表达的定量。每微管蛋白*运动神经元核区核B-catenin表达量的定量(um.2)。图(E-)显示3个生物学重复的平均值±s.e.m.(n=30张图像)。图(E和I):采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。图(F和H):Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
讨论：
最近，星形胶质细胞异质性是一个被普遍接受的术语，用于描述它们在中枢神经系统中的形态差异和空间位置。在作者的星形胶质细胞群中，失去支持和获得毒性功能之间的动态相互作用指明了一种异质性的功能，并有利于星形胶质细胞在ALS中的更大的有待探索的作用。将健康的大鼠星形胶质细胞移植到表达突变的人SOD1蛋白的转基因大鼠体内，已被证明可以减少小胶质细胞增生，减轻运动神经元的损失并延长病程。与此一致，作者的IC星形胶质细胞能够改善或挽救所有畸变，这表明基因治疗针对动态和迁移的星形胶质细胞而不是静态和有丝分裂后的运动神经元的有益效果。此外，作者关于星形胶质细胞在全人类系统NMJ病理学的数据支持之前的研究结果，其中来自sALS患者的hiPSC衍生的星形胶质细胞注射到小鼠体内，导致NMJ失神经支配和随后的运动缺陷。FUS-ALS和sALS之间的这种相似性表明星形胶质细胞诱导的NMJ毒性是ALS的一般机制。进一步整合到其他细胞类型，如上运动神经元、中间神经元和其他神经胶质细胞，除了提高NMJ模型在药物测试和治疗开发中的价值外，还将促进对疾病过程的理解。
结论：
作者的研究表明，星形胶质细胞在ALS发病机制中发挥着重要作用，通过多种毒性获得和失去支持机制，导致运动神经元网络及NMJ形成和功能受损。此外，作者提出一种星形胶质细胞尝试通过运动神经元中WNT/β-catenin通路的上调来抵消毒性，但成功有限。此外，作者的全人类多细胞微流体模型为进一步研究提供了平台，并可用于药物开发和测试。