1、细胞毒性实验总结一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识1二、细胞毒性实验方案确实立3三、细胞毒性实验方法稳定后的局部数据4四、细胞毒性实验质量评价指标5五、细胞毒性实验SOP6一目的6二适用范围6三责任人6四规程61.试验准备72.试验操作83.数据处理和分析8六、总结9一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质药物作用于细胞根本结构和/或生理过程,如细胞膜或细胞骨架结构,细胞的新陈代谢过程,细胞组分或产物的合成、降解或释放,离子调控及细胞分裂等过程,导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱,所引发的不良反响.按作用机制可分3种类型：根本细胞毒性,涉及一种或多种上述结构或功能的改变,作用于
2、所有类型的细胞；选择细胞毒性,存在于某些分化细胞上,主要通过化学物质的生物转化,与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；细胞特殊功能毒性,对细胞结构和功能损伤稍微,但对整个机体损伤非常严重.类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现.毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰,任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑.1983年Ekwall提出根本细胞功能的概念,即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤,却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡.有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间
4、定,竞争性抑制依赖于病毒DNA和RNA逆转录酶.恩替卡韦ETV为环氧羟碳脱氧鸟昔,具有较强的抗HBV作用,也可抑制拉米夫定引起的YMDD变异病毒株感染.在体外应用HBVDNA转染的HepG2细胞作药敏试验,结果该药抗HBV作用最强.恩替卡韦？拉米夫定？泛昔洛韦抑制HBV的半数有效浓度EC50分别为0.00375mol/L0.116科mol/L文献报道多在几nM到几个眼,范围较宽、100科mol/L在土拨鼠肝炎病毒WHV感染的土拨鼠动物模型,口服恩替卡韦0.1mg/kg.d共12周,血清WHV转阴.以后,每周口服0.1mg/kg,血清WHV仍维持阴性.因此3TC和ETV常被用作抗HBV药物筛选时
6、A及我国药品审批部门推荐的检测方法之一.其根本原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够复原黄色的澳化3-4,5-二甲基曝陛-2-2,5-二苯基四氮陛3-4,5-dimethylthiazol-2yl-2,5-diphenylterazoliumbromide,MTT为蓝紫色的不溶于水的甲月赞formazan,甲月赞的生成量在通常情况下与活细胞数成正比.由于甲月费的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸光度OD值而得知,因此可根据OD值推测出活细胞的数目,从而了解药物抑制或杀伤细胞的水平.目前已有MTT的升级替代产品,如XTT、MTS、WST-8等,三种方法的比拟见下表.尽管CCK-8方法简
7、便、准确、灵敏度高,但比MTT的价格要贵不少,所以一般来说,还是MTT法用的多.三种方法的比拟MTT法XTT法CCK-8法WST-8法甲月赞水溶性难溶性水溶性水溶性检测波长490nm450nm450nm性状粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用毋需顶制使用有机溶剂DMS诚其它溶剂一一方便性+检测速度+重复性+稳定性+工作量-对细胞毒性-对人体毒性一-二、细胞毒性实验方案确实立在确定MTT法作为细胞毒性实验的方法之后,我们对实验中可能涉及的各个参数进行了摸索和优化.最初,由于一切都是未知,因此常常几个参数一起调整,使得各个参数对结果的影响不是很清楚,走了一些弯路.后期逐渐摸清了参数对
10、lue2value3MeanSTDEV%CV%Viability%STDEV20020.2150.0178.01911.6410.1601000.3690.0215.73620.0110.493500.8580.0252.91146.5292.720251.2270.13510.96766.5409.9491.4800.0674.50480.2780.3201.6200.0684.17987.8340.0511.7400.0522.98994.3420.05701.8440.0422.251100.0000.000典型ETV的CC50实验数据||ririrBHi-iair|nBRriBrr
11、BHi-iair|nBRriBr11HH|aiviBBriiiaiviBBriiiinania|inania|rrii32541262505121QZ4204-64091519216334327003TC3TCuMuM四、细胞毒性实验质量评价指标对细胞毒性进行质量评价白指标初步定为以下7个：1.OD平均值：反映复孔间OD值的平均水平,OD值越大,细胞数越多.2.复孔OD值间的标准差STDEV:反映各复孔OD值之间的离散情况.标准差越大,说明复孔间不平行性越大,操作误差越大.3.复孔OD值间的变异系数CV:也是反映复孔间OD值离散情况的指标.由于OD值间的标准差STDEV的单位和O
12、D的单位是一致的,不能表达离散的权重,因此引入变异系数CV.这一指标以百分比的形式表现OD值的离散情况,形象、直观.4.存活率%Viability：计算各药物浓度下细胞的存活率可以反映细胞存活情况,该值越大,说明药物的细胞毒性作用越小.5.存活率的标准差STDEV:该值反映如以每个复孔均作为单独的实验,那么同批的复孔可以看作数批实验,此时存活率的分布情况.该指标越大,说明复孔间越不平行.6.存活率的变异系数CV:该指标反映各复孔间存活率的离散情况,该值越大,说Date:09/07/07compound:3TCcelldensity:5x103incubationtime:7drugadd
13、ing:2times2%FBS180ul2#plateCC50=2130uMConc.(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV%Viability%STDEV80000.2090.03918.81511.7961.9024000720.0193.23832.3351.73920000.8420.0505.99447.5984.99010001.3070.0151.11173.8843.0565001.5880.0342.16689.7684.9662501.6480.0090.52993.1602.7951251.7100.0613.57196.6460.24101
14、.7690.0170.934100.0000.000compound3TCcelldenscompound3TCcelldensity5x103ity5x103Incubationlimlime7druge7drugaddin*addin*timestimes2%2%FBSFBSrate=iCC50=2i30uMrate=iCC50=2i30uM川SO明说明每一列细胞孔即一系列稀释单孔间不平行性越大.7.半数致细胞毒性浓度concentrationofcytotoxicity50%,0050:指对半数细胞产生毒性作用所需浓度.该指标可用来反映实验系统是否正常工作及评价未知药物对细胞的毒性.五
15、、细胞毒性实验SOP化合物抗HBV活性细胞毒性实验标准操作规程MTT法一目的使实验操作标准化,保证正常工作的进行.二适用范围本标准适用于MTT法检测抗HBV药物细胞毒性的操作及计算0050o三责任人分子生物学组操作人员对本规程负责.四规程术语：0050concentrationofcytotoxicity50%:半数细胞毒性浓度,指对半数细胞产生毒性作用所需浓度.在本实验中,指致50%细胞死亡所需的药物浓度.本实验旨在通过MTT法检测未知化合物对转染了HBV基因组的细胞系HepG的细胞毒性.背景知识：MTT法是二十世纪八十年代开展起来的一种快速、简便的测试方法,目前已被广泛用于药物体外筛选实验
16、.其根本原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够复原黄色的澳化3-4,5-二甲基曝口坐-2-2,5-二苯基四氮口坐3-4,5-dimethylthiazol-2yl-2,5-diphenylterazoliumbromide,MTT为蓝紫色的不溶于水的甲月赞formazan,甲月赞的生成量在通常情况下与活细胞数成正比.由于甲月费的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸光度OD值而得知,因此可根据OD值推测出活细胞的数目,了解药物抑制或杀伤细胞的水平.MTT法是一种检测细胞活性的方法.与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种常规方法-细胞计数法和同位素掺入法相比,MTT法具有操作简便、快速、准
17、确、廉价及不使用同位素等优点,已广泛应用于生物医学的诸多领域.同时,MTT法也是FDA及我国药品审批部门推荐的检测方法之一.1.试验准备1.1.试剂和耗材：1.1.1试剂：胎牛血清FBS;G418;DMEM培养基高糖；0.25%Trypsin-EDTA;磷酸盐缓冲液无车镁；DMSO;1.1.2耗材：0.2针头过滤器有机相和水相；1ml和10ml注射器；96孔细胞培养板；移液管5ml、10ml;移液器Tip头.1.1.3溶液配制：1.1.3.1完全培养基：DMEM和FBS按9：1体积比混和,并添加1/1001/50体积比的hepes和终浓度为380回/ml的G418.维持培养基：DMEM和FBS
18、按49：1体积比混和,并添加1/1001/50体积比的hepe环口终浓度为3800ml的G418.1.1.3.2磷酸盐缓冲液无钙、镁：8g/LNaCl,0.2g/LKCl,1.44g/LNa2HPO4,0.24g/LKH2P.4,pH7.4,高压蒸汽灭菌121c20min,4c保存.注意：实际配制时,有些试剂含多个分子的水,需将该局部的质量算进去.1.2.细胞培养：HepG培养采用完全培养基,于37C,5%CO2细胞培养箱培养.接种时,细胞密度限制在1X105/ml2X105/ml左右.1.3.细胞计数：见附件细胞计数.1.4.细胞铺板：细胞计数后,用完全培养基稀释成M04ml,在5%CO
19、2,37c培养24h备用.注意：在向96孔细胞培养板中接种细胞时,应注意每次吸取细胞悬液前,都应轻轻摇匀,尽量减少每次吸取的细胞数目的差异.1.5.将药物用少量DMSO溶解,并用0.2科订次性针头过滤器有机系过滤除菌,此为母液其浓度通常为预先设计的最高待测浓度的1000倍或以上；然后用维持培养基将母液稀释到实验预先设计的最高待测浓度.如配制的母液体积过小如低于1ml,不便于过滤,可先用完全培养基将其稀释到最高待测浓度,再用0.2科厂次性针头过滤器水系过滤后分装备用.2.试验操作2.1.药物稀释：药物采用倍比稀释.可在EP管中稀释.第一管为最高待测浓度的药液.自第二管分别参加一定量的维持培养基,
20、然后从第一管吸取等量的药液至第二管,吹打混匀后,弃去tip头并换新tip头,从第二管吸取等量药液至第三管,吹打混匀.依此操作直至倒数第二管.最后一管为维持培养基,不含药物.2.2.药物处理：弃去细胞培养液,注意吸除干净.然后吸取已稀释的药液180出睢IJ对应的细胞孔中.各浓度组均设三孔重复,最后一排孔为细胞对照.另设培养基对照.如图1.2.3.加药后在5%CO2,37c细胞培养箱培养72h;按上述步骤换新鲜含药培养基,共2次.最后一次换药后再培养72h,准备检测.图1黄色局部为PBS,无细胞；绿色为培养基对照；粉色、蓝色局部为两种不同的药物处理,每种药物设三个重复,8个浓度,红色局部为细胞空白对照.2.4.MTT检测：将MTT母液5mg/ml,10X用PBS稀释为1X.去除各孔中的培养液注意：尽可能去除干净！,参加1XMTT,200山孔,在37c培养箱孵育1h;去除MTT,向各孔参加DMSO,200山孔,在酶标仪上振荡20min,读取吸光度值OD570