Cannabidiol通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应抑制SARS-CoV-2复制
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）是导致2019年冠状病毒病（COVID-19）的罪魁祸首，这场大流行继续在全球范围内造成广泛的发病率和死亡率。SARS-CoV-2是已知的第七种感染人类的冠状病毒。这些冠状病毒包括SARS-CoV、229E、NL63、OC43、HKU1和MERS-CoV，可引起从普通感冒到更严重的疾病的一系列症状(1)尽管最近有疫苗，SARS-CoV-2仍在迅速传播(2)强调了替代治疗的必要性，特别是对于那些倾向于或获得疫苗有限的人群。迄今为止，很少有治疗方法能阻断SARS-CoV-2的复制和病毒的产生。
SARS-CoV-2是一种正义单链RNA（+ssRNA）包膜病毒，由一个脂质双层和四个驱动病毒颗粒形成的结构蛋白组成。尖峰（S）、膜（M）和包膜（E）是病毒膜的整体蛋白，促进病毒离子出芽，同时也吸收核衣壳蛋白（N）和病毒基因组RNA进入新生病毒离子。与它的近亲SARS-CoV一样，SARS-CoV-2主要通过病毒S蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合进入人体细胞(三–5)之后，S蛋白通过跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）或其他蛋白酶水解成两个促进病毒进入宿主细胞的非共价结合肽（S1，S2）。这个N-S1端与ACE2受体结合C-S2末端介导蛋白水解后的病毒细胞膜融合。根据细胞类型，病毒进入也可以发生在ACE2结合后，而不依赖于蛋白水解裂解(6–8)进入细胞后，SARS-CoV-2基因组被翻译成两个大的多肽，被两种病毒蛋白酶Mpro和PLpro裂解(9,10)，以产生15种蛋白质，此外还合成亚基因组rna，该rna编码另外10种辅助蛋白和4种结构蛋白。这些蛋白质使病毒能够复制、组装和发芽。为了抑制SARS-CoV-2β冠状病毒以及其他正在进化的致病性病毒的感染，我们测试了许多针对宿主应激反应途径的小分子的抗病毒潜力。
为了检测CBD对SARS-CoV-2复制的影响，我们在感染SARS-CoV-2之前，用0-10μM的CBD预处理表达外源性人ACE-2受体（A549-ACE2）的A549人肺癌细胞2小时。48小时后，我们监测细胞的病毒尖峰蛋白（S）的表达和病毒滴度。在无毒条件下，CBD可显著抑制病毒复制，EC50为1μM(图1A;图S1A）。CBD还抑制了人Calu3肺和VeroE6猴肾上皮细胞中SARS-CoV-2的复制（图S1B），在有效剂量下未观察到毒性（图S1C，D）。最后，我们检测了三种SARS-CoV-2变异株（α、β和γ），它们感染细胞的能力被CBD抑制(图1C).
CBD在肠道和肝脏中迅速代谢为两种主要的代谢物，7-羧基-大麻酚（7-COOH-CBD）和7-羟基-大麻酚（7-OH-CBD）。7-COOH-CBD水平高出40倍，7-OH-CBD水平为人血浆CBD水平的38%(15)CBD及其7-OH-CBD代谢物是治疗癫痫的有效等电位成分(13)与CBD一样，7-OH-CBD能有效地抑制A549-ACE2细胞中SARS-CoV-2的复制(图2C)对细胞无毒（图S2H，I）。对每天服用FDA批准的CBD溶液（Epidiolex）1500毫克的健康患者的血浆水平进行分析，结果显示，该药物的最大浓度（C最大值)7天时CBD和7-OH-CBD分别为1.7μM和0.56μM；C最大值与高脂肪食物共服可进一步提高数倍(15)总的来说，这些结果表明CBD及其代谢物的有效血浆浓度在抑制人类SARS-CoV-2感染的治疗范围内。
CBD可能通过阻断病毒进入宿主细胞或在感染后的后期阶段起作用。据报道，CBD可降低包括A549在内的一些上皮细胞ACE2的表达(16)我们首先确定了CBD是否抑制了A549-ACE2、Calu-3和veroe6细胞中的SARS-CoV-2受体。ACE2的表达没有下降(图3A;图S4A，B）。此外，用SARS-CoV-2峰蛋白或水泡性口炎病毒（VSV）糖蛋白假型慢病毒的分析(17)结果表明，10μM-CBD对刺状病毒进入细胞的抑制作用较弱，提示其抗病毒作用主要是由其它机制引起的。通过使用抗spike抗体，可以有效地阻止spike伪型慢病毒感染，而不是VSVg，证实了该方法的稳健性(图3B和无花果。S3A和B）。与病毒进入的微不足道的影响相比，CBD在感染后2小时和6小时抑制宿主细胞中SARS-CoV-2尖峰蛋白表达非常有效（约95-99%）(图3C)即使在有抗棘蛋白抗体以防止再感染的情况下也是如此(图3D)提示CBD在感染周期的早期，即进入后的步骤中起作用。在感染后15h，CBD对抑制SARS-CoV-2也有部分有效（约60%）(图3C)提示可能对病毒的装配和释放产生二次作用。为了评估CBD是否可能阻止病毒蛋白酶Mpro或PLpro处理病毒蛋白，我们测定了它们的活性体外（图S4C，D）。CBD不影响两种蛋白酶的活性，增加了CBD靶向宿主细胞过程的可能性。
为了更好地了解CBD的特异性抗病毒作用，我们分析了未感染或SARS-CoV-2感染细胞的裂解产物中的rna序列，这些细胞用灭活的CBDV同源物处理24小时。用CBD病毒诱导的尖峰蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白的病毒基因诱导率仅为60%，而CBD的诱导率为99%(图5A，B)在A549-ACE2细胞中，CBDV治疗引起的转录组变化比CBD少，并且在逆转SARS-CoV-2诱导的转录变化方面基本无效(图5C).使用Metascape的聚类分析显示只有几个簇显示CBDV逆转了病毒转录组的变化(图5D)这些包括CBDV诱导的自噬和脂质代谢（第1类）以及受到CBDV抑制的蛋白质翻译/细胞周期/DNA复制（第3类）。
表1对CBD和/或SARS-CoV-2病毒应答的PERK、IRE1或ATF6基因表达和功能的诱导。
RNA-seq基因表达数据用于GSEA的三个GO术语“PERK介导的UPR”、“IRE1介导的UPR”和“ATF6介导的UPR”（基因本体编号3649836936500）。标准化富集分数显示在“GSEANES”栏下（分数越高=富集程度越高）。PERK、IRE1和ATF6之间转录表达差异的折叠变化在“RNA序列折叠变化”列下显示。
*ND=由于没有足够的基因来获得可靠的数值而未确定。
CBD抑制病毒感染和促进RNA降解的另一个机制是通过诱导干扰素信号通路。干扰素是宿主对病原体暴露最早的固有免疫反应之一(23)。如报告所示(24)，SARS-CoV-2感染抑制干扰素信号通路(图7A，以及图S17）。该途径中有许多基因，如ISG15、IFIT1、IFIT3、SOCS1和OAS1，后者是一种干扰素诱导的基因，可导致RNaseL活化和RNA降解(25)，在病毒存在下，CBD单独作用下可适度上调(图7A无花果。第18、19节）。这些结果与CBD降低有效病毒滴度以使干扰素途径正常激活的可能性相一致。同时，CBD有效地逆转了病毒诱导的细胞因子，这些细胞因子在感染的后期会导致致命的细胞因子风暴(图7B)相反，不活跃的同源基因CBDV不会显著诱导干扰素途径中的基因或阻止细胞因子的诱导(图6A,7安,7摄氏度，图S20A、B和S21）。
为了直接测试干扰素可能部分解释CBD抗病毒活性的可能性，我们在2.5μMCBD治疗和病毒感染之前，将ACE2-A549细胞暴露于抗I型（α，β，ο）和II型（γ）干扰素的混合抗体中。结果表明，抗干扰素抗体降低了CBD的抗病毒作用，部分挽救了SARS-CoV-2感染(图7D)总的来说，这些结果表明CBD部分通过激活IRE1α和干扰素途径抑制SARS-CoV-2感染，导致病毒RNA降解和随后病毒诱导的宿主基因表达改变，包括细胞因子。
包括阳离子两亲药物在内的几种药物可阻断SARS-CoV-2在培养细胞中的复制，但不能体内(26)，我们确定了CBD是否降低了雌性K18-hACE2小鼠的病毒滴度(27)在用SARS-CoV-2（2x10）经鼻激发前，小鼠每天两次腹腔注射CBD（20或80mg/kg），持续7天4PFU）。在挑战之后，CBD的管理继续每天两次，持续4天(图8A)CBD治疗在感染后第5天显著抑制了病毒在肺部和鼻甲的复制，呈剂量依赖性(无花果。8B-C段)低剂量CBD使肺和鼻甲的病毒载量分别降低4.8倍和3.7倍，而高剂量则分别使肺和鼻甲的病毒滴度降低40倍和4.8倍。在此期间，小鼠没有临床疾病迹象，体重也没有明显变化(图8D)这些结果证实了CBD作为SARS-CoV-2感染早期抗病毒药物的临床前疗效。
CBD抗病毒活性的一个机制是在宿主对病毒病原体的免疫反应激活后直接或间接诱导干扰素途径。事实上，干扰素已经被临床测试为治疗COVID-19的潜在疗法(30)当严重的内质网应激过度激活时，IRE1α的RNase活性导致许多内质网局限性mRNAs（RIDD）的核内溶解衰变，随后激活RIG-I和干扰素(18)尽管SARS-CoV-2诱导了IRE1α的激酶活性，但在XBP1剪接监测到的RNase活性中没有激活。因此，CBD诱导的IRE1α的RNase活性可能是病毒RNA降解和RNA片段诱导干扰素产生的潜在原因。需要进一步的研究来确定CBD的抗病毒作用是否与ER应激反应有关。重要的是，CBD还能抑制病毒感染时细胞因子的激活，降低免疫细胞募集和随后肺部及其他受影响组织中细胞因子风暴的可能性。这些结果补充了先前的研究结果，即CBD抑制巨噬细胞等免疫细胞中细胞因子的产生(31)因此，CBD不仅有可能在感染的早期起到抗病毒作用，而且在感染后期保护宿主免受免疫系统过度活跃的影响。
CBD作为一种潜在的SARS-CoV-2预防剂具有许多优点。CBD作为一种THC含量小于0.3%的食品添加剂，广泛存在，无限制使用。通过合理的处方、质量控制和给药，CBD可以预防性地使用，而不是最近的抗病毒药物。CBD的摄入有多种可能，包括吸入和鼻腔给药。CBD阻止病毒进入细胞后的复制，因此，很可能有效地对抗带有突变棘蛋白的病毒变体。与雷米昔韦或抗病毒抗体等药物不同，CBD给药不需要在医院注射。最后，CBD只伴有轻微的副作用(32).
为了进一步评估CBD作为阻断SARS-CoV-2感染的治疗方法的前景，需要进一步研究CBD给患者的最佳方式以及临床试验。我们的动物研究为临床试验中评价CBD作为抗SARS-CoV-2治疗剂提供了临床前支持。我们提倡精心设计的安慰剂对照临床试验，使用已知浓度和高度特性化的配方，以确定CBD在预防和治疗早期SARS-CoV-2感染中的作用。必要的人体内浓度、最佳路线和配方仍有待确定。我们强烈警告，在目前可用的配方中，尤其是在不了解该天然产品的严格随机临床试验的情况下，将CBD作为预防或治疗药物的诱惑，包括食用药物、吸入剂或topicals(33).
所有SARS-CoV-2感染都是在芝加哥大学HowardT.Rickett区域生物污染实验室在生物安全等级3的条件下进行的。体内感染是在美国路易斯维尔大学区域生物污染实验室生物防御和新兴传染病预测医学中心的ABSL-3条件下进行的。DMEM+2%FBS中的细胞用CBD或其他抑制剂处理，或用2倍稀释液处理2小时，从10μM开始，每次试验三次。在含有适当浓度药物的培养基中，A549-ACE2细胞感染的MOI（多重感染）为0.5。在含有适当浓度药物的培养基中，感染veroe6细胞的MOI为0.1。48h后，用3.7%福尔马林固定细胞，封闭，用1:1000稀释的小鼠抗棘突抗体（GTX632604，GeneTex）探针4h，冲洗后用抗鼠HRP探针1小时，洗涤后用DAB底物培养10分钟。光镜下计数阳性细胞（n>40）为盲样。用菌斑法测定病毒滴度。简单地说，在37℃下用一系列的病毒样品稀释液感染E6细胞单层1小时。然后移除病毒接种物并用含有1.25%羧甲基纤维素的MEM覆盖介质代替。细胞孵育72小时后，去除覆盖培养基，用10%福尔马林固定，用0.25%结晶紫溶液染色。在稀释池中计数斑块，在10-100个斑块之间，并计算病毒样本的原始浓度。利用GraphPad棱镜对数据进行分析和绘图，并从响应曲线的非线性拟合中提取EC50值。
在2%DMEM中用不同浓度的不同化合物处理细胞，从10μM开始，下降1/2，再稀释6次。细胞与药物孵育48小时。细胞用10%福尔马林溶液固定30分钟。然后用1%结晶紫溶液染色30分钟，然后干燥板，并通过在TECANM200平板阅读器上测量595nm处的吸光度来评估结晶紫染色的量。将吸光度读数标准化为未经药物治疗的对照孔的吸光度读数，以测量有无药物治疗的细胞生长差异。
A549-ACE2细胞在感染前2小时或感染后2、6、15小时用10μM的CBD处理。用0.5的MOI感染细胞2小时。然后，用含有CBD或DMSO的培养基代替感染培养基，并在37℃下培养16小时。在一个实验中，感染后2小时加入CBD，用CBD或DMSO和μM中和抗体（活性基序001414）代替感染介质。16小时后，用10%福尔马林固定样品，并用IHC法测定穗蛋白。中和抗体的效率通过在37°C下将400pfu病毒（含或不含100μM抗体）培养1小时来测试。然后用该混合物感染A549-ACE2细胞16小时。如上文所述，对棘状阳性细胞进行量化。
A549-ACE2细胞在感染前2小时用2.5μM的CBD、1μg/ml的人IFN-γ抗体（MAB285-100）和1:25稀释的人Ⅰ型干扰素中和抗体混合物（PBLassetyScience39000-1）处理。然后用0.5moi感染细胞并孵育24小时，之后收集上清液并用上述菌斑试验测定活性病毒。
慢病毒库是利用带有单导RNA（sgRNA）的扁豆蛋白蛋白v2（Addgene）和针对IRE1序列（CGGTCACTCACCCCGAGCC）的慢病毒库。用4μg/mL嘌呤霉素培养基对感染的A549-ACE2细胞进行多克隆筛选和保存1周。
CBD可通过从大麻然后诱导植物原料发生化学脱羧反应，或通过植物原料或提取物中所含大麻素的脱羧，进而分离出CBD。cannadivarin（CBDV）是一种天然存在的CBD同源物n-丙酯代替CBDn-戊基侧链。大麻酚（CBG）以大麻酚酸的形式存在，是四氢大麻酚酸和CBDA的代谢前体欧洲栗四氢大麻酚（THC）是四氢大麻酚酸脱羧后得到的环化CBD同源物。THC存在于欧洲栗在两个Δ中9-独联体和Δ9-反式立体异构体。大麻素（CBC）以大麻酚酸的形式存在，代表第三种可能的大麻素酸代谢物，在香叶基残基中含有一个铬烯环。
CBD，CBC，CBG，Δ9-反式-THC，Δ9-独联体-采用离心分配色谱（CPC）、逆流分离技术和双相液-液溶剂体系从大麻油中分离出THC和CBDV，并从粗大麻SFE提取物中分离出CBDA。
对于作为溶液提供的商业样品，在真空和450μL氘化甲醇（MeOH）中小心地除去溶剂-d4)用精密注射器加入残留物中。用玻璃移液管将溶液转移到5-mm核磁共振管中，用25μL溶剂冲洗小瓶三次，然后将冲洗液转移到同一个核磁共振管中，最终体积为525μL。将商业和分离样品作为固体直接称重到5-mm核磁共振管中，并使用精密注射器添加500μL溶剂。为了分析商业大麻油制剂，将10滴（0.25毫升相当于14-15滴）直接加入到5毫米核磁共振管中。在0.01mg精密天平上测定了大麻油在核磁共振管中的净重为198.50mg，并加入了0.90mg二硝基苯甲酸作为内标；325μL氯化镉三和10μL镉三增加了外径，并对管道进行了火焰密封。
293T和293T-ACE2细胞在DMEM（康宁10017CV）和1倍丙酮酸钠（Gibco11360070）和10%FBS（HyCloneSH30910）中培养。用SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1）spike蛋白或VSV-G假定型的慢病毒颗粒如所述(19)简单地说，用第三代慢病毒包装载体（HDM-Hgpm2、HDM-tat1b、pRC-CMV-Rev1b）、转移载体（噬菌体-CMV-ZsGreen-W）和SARS-CoV-2尖峰（HDM-IDTSpikefixK）或VSV-G（HDH-VSVG）转染293个T细胞。转染后36小时和60小时收集的上清液混合，注射器过滤并冷冻在一次性使用的小份中80°C。用于慢病毒生产的所有质粒均由JesseBloom博士（西雅图华盛顿大学）提供。
293个T-ACE2细胞接种于1.2×104每96个孔的细胞在黑色壁上，干净的底板。第二天，在二甲基亚砜中制备2倍稀释度的CBD储备液（10mM），然后在完全DMEM或假病毒制剂中制备1:1000稀释液。SARS-CoV-2棘状假病毒未稀释，VSV-G假病毒在完全DMEM中稀释1:1500。细胞和假病毒分别在37℃下用CBD稀释液预处理2小时和1小时。细胞被假病毒感染72小时，用4%多聚甲醛固定，用核标记物（hoechst33342，ThermoFisherH3570）染色并成像。293个T-ACE2细胞由jessebloom博士（西雅图华盛顿大学）慷慨提供。
293t或293t-ACE2细胞接种于1.2×104每96个孔的细胞在黑色的壁上，干净的底板。第二天，将SARS-CoV-2尖峰中和抗体（SinoBiological40592-R001）在完全DMEM中稀释至300ng/100ul/96孔，随后进行3倍稀释。中和抗体与假病毒孵育1小时。37℃时，细胞被假病毒感染+/中和抗体72小时，用4%多聚甲醛固定，用核标记物hoechst33342染色并成像。
A549-ACE2细胞经CBD、载体（DMSO）处理或24小时不处理。首先用冰冷的PBS清洗细胞。通过在4℃下用添加蛋白酶抑制剂（Roche4693159001）、PMSF（Roche10837091001）和磷酸酶抑制剂（GB-450）的Laemmli样品缓冲液（Bio-rad1610747）直接溶解细胞制备全细胞提取液。蛋白质样品最终在98℃下煮沸5分钟。用ACE2抗体（Abcam108252）和α-微管蛋白（invitrogenma1–19401）作为对照，进行免疫印迹。为了验证A549-ACE2中IRE1α基因敲除，使用了细胞、IRE1α抗体（细胞信号，3294S）和GAPDH（细胞信号，5174S）。用Licor-Odyssey-Fc对印迹进行成像和定量。
用人血管紧张素转换酶2（ACE2）蛋白稳定地高表达肺泡A549细胞，每孔接种10000个细胞。将大麻酚或载体加入细胞中。用二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，D2650-100mL）将大麻酚（CaymanChemical，90080）溶解在10mM储备溶液中。CBD的最终浓度为10μM。然后去除病毒储备，并用含药物的2%FBS-DMEM培养基代替。在提取总RNA之前，将细胞培养24小时，然后使用NuclearSpin96RNA试剂盒（Takarabio，740709）。每个实验条件下进行三次独立的生物复制，总共有12个RNA样本。RNA样本质量检查、文库构建和测序由芝加哥大学基因组学研究所按照标准协议进行。平均RNA完整性评分为8.9。所有12个样本通过NovaSeq6000测序仪进行两次测序，以产生成对的末端100bp读数。两个来自FASTQ下游的样本流在处理前合并为两个样本流。如上所述，从大麻油中分离出cannadivarin（CBDV），并与CBD进行了相同的研究。CBDV样本的RNA完整性平均得分也为8.9。
使用本地Galaxy20.05实例分别分析了CBD和CBDV处理细胞的RNA序列数据(34).使用Trim-Galore对原始测序读数执行质量和适配器修剪！0.6.3款(35).使用RNASTAR2.7.5b将读数映射到人类基因组（UCSChg19带GENCODE注释）和SARS-COV-2基因组（NCBI组件ASM985889v3，Ensembl注释）(36)。根据featureCounts1.6.4计算每个样本的映射读取数(37)生成每个基因的读取计数。使用DESeq21.22.1分析原始计数在实验条件下的差异表达(38)，并生成标准化的基因表达矩阵和样本的PCA图。
通过观察者的基因组片段数，选择1.9个(39)使用对齐读取来自RNA星的数据（见上文）。XBP1读取的总次数按上面的featureCounts计数。对于每个样本，通过将包含选择性剪接位点的读数除以总的XBP1读数来确定相对的XBP1剪接。
用高容量cDNA逆转录试剂盒（ThermoFisher，4368813）从RNA样品中合成cDNA。在分子生物学级水中稀释cDNA样本，并使用AppliedBiosystemsPowerUpSYBRGreenMasterMix（ThermoFisher，A25776）在罗氏LightCycler96仪器上进行qRTPCR实验。结果用RocheLightCycler96软件进行分析。RPL13A作为参考基因。使用了以下引物对（基因名：正向引物、反向引物）：
ERN1:CCGAACGTAGTCGCTACTTCCT、CGCAAGTCTCTTCTGCTCCACA。
EIF2AK3:gtcccaaggcttggaatctgtc，cctaccagagagagttctgg。
ATF6:CAGAGAGTACCAACGCTTAGCC、GCAGACTCCAGGGTGTGGAG。
IFIT1:gccttgctgaaggtggagaa，atccaggcgataggatc。
IFIT3:CCTGGAATGCTTACGGCAAGCT、GAGCTCTGCCCAA。
ISG15:CTCTGAGCCATCCTGGTGAGA，AAGGTCAGCCAGAACAGGGTCGT。
OAS1:aggaaggtgctctcgaggtag，ggactgaggaggagagacaacaggt。
SOCS1:ttcgctctagcgtgaagtgg，tagtgccagcagctcgagaga。
备选拼接XBP1:gctgagtcgcagggt，ctgggtccagttgtccagaat。
总计XBP1:tgaaacagagtagcagctcttaactc。
RPL13A:CTCAaggtgtgttgaggcatcc，联系TCCAGCAACCGTGAG。
qRT-PCR用于定量剪接型XBP1（XBP1s）的相对表达，方法是使用特定的引物对人类选择性剪接的XBP1和总的XBP1（引物序列如上所述）(40)通过计算XBP1与总XBP1信号的比值，确定XBP1的选择性剪接的相对百分比（%XBP1s）。
为了确定6个聚类的主题，使用Metascape对每个聚类中的基因进行功能基因集富集分析(41)选择以下类别进行富集分析：GO分子功能、KEGG功能集、GO生物过程、典型途径和KEGG途径。Metascape的其他参数：最小重叠=3，p值截止值=0.05，最小富集度=1.5。确定病毒感染时CBD逆转哪些活性的基因集，输入基因列表包括被病毒显著下调的基因（差异表达比较vehinfectvsvehmock，q值截止0.01），同时也被CBD显著上调（差异表达比较CBD感染vsvehinfect，q值截止0.01）。第二个列表包括被病毒显著上调的基因（比较vehinfect与vehmock的差异表达），同时也被CBD显著下调（比较CBD感染与veh感染的差异表达）。使用相同的Metascape方法对这两个基因列表进行基因集富集分析。同样的分析也在RNA序列实验中进行，包括CBDV和SARS-CoV-2的差异表达数据，q值截止值为0.05。GSEAv4。使用1.0对基因本体论术语PERK介导的未折叠蛋白应答和IRE1介导的未折叠蛋白应答进行特定的基因集富集分析，这些数据来自于涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA-seq实验(42,43).
9至11周龄雌性K18-hACE2小鼠(27)从杰克逊实验室购买（库存034860）。驯化后，小鼠接受CBD治疗（20或80mg/kg），每日两次腹腔注射，体积为0.1ml。每次治疗前立即制备注射溶液。首先，将供应商D的CBD粉末溶解在100%乙醇中。然后将CBD溶液与CremophorEL（MilliporeSigma238470）和PBS溶液按1:1:18的比例混合。以1:1:18混合100%乙醇、克莫泊尔EL和PBS制备溶媒注射溶液。对于每一次注射，CBD的最终量为每公斤小鼠体重20毫克或80毫克，具体取决于治疗组。对照组仅用溶媒治疗或不接受治疗。治疗7天后，麻醉所有动物，并通过鼻内滴注0.05ml的2x10^4pfu的SARS-CoV-2（nCoV/Washington/1/2020）激发。激发后，CBD治疗继续每天两次，持续4天。每天两次监测小鼠临床疾病的发展情况。每天测量一次体重。在病毒攻击5天后，所有动物被人道地安乐死，收集鼻甲和肺组织。组织在无菌PBS中使用手持式组织匀浆器（OmniInternational）进行均质，并储存在病毒滴定80°C。
VeroE6细胞（ATCC#CRL-1586）以20000个细胞/孔的密度接种到96个孔的平底组织培养板（Nunc）中，并在37°C和5%CO下培养过夜2以及湿度。匀浆组织在4℃下以8000rpm离心10min，收集上清液并连续稀释10倍（最多107)在病毒生长培养基中（DMEM含有5%的FBS和1%的抗生素/抗真菌溶液）。隔夜培养后，用PBS冲洗细胞板两次，并将连续稀释液一式四份添加到每个孔中。在37°C的温度下，在加湿的培养箱中用5%的CO培养板23天后，用含10%中性福尔马林的0.1%结晶紫染色，并对细胞病变（CPE）发展进行评分。TCID50剂量按Reed和Muench法计算(44)并校正每克肺匀浆的重量。路易斯维尔大学动物管理委员会批准了所有动物护理工作。所有与SARS-CoV-2活病毒有关的工作都得到了大学机构生物安全委员会的批准，并在生物安全三级控制范围内进行。
所有患者数据分析均由国家COVID队列协作组织和芝加哥大学生物科学部机构审查委员会（IRB21–0591）批准，由于研究人员无法轻易确定研究参与者的身份，因此他们同意放弃同意，研究人员不与参与者联系，也不会重新确认参与者的身份。患者数据分析方法和结果的详细说明见患者分析补充资料。
数据显示为平均值±标准差。对于RNA序列差异表达分析，使用DESeq2版本1.22.1，校正最小FDRP值（Q值）对于涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA序列实验，显著性阈值为0.01；对于涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA序列实验，显著性阈值为0.05。在基因集富集分析中，Metascape的使用量最小P值显著性阈值为0.05。对于药物治疗的EC50计算，使用GraphPadPrism软件对四个参数进行非线性曲线拟合。Prism还用于非配对t检验和单因素方差分析，其统计学意义为p<0.05。有关患者数据统计分析方法，请参阅《患者分析补充》的统计分析部分。
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