(江南大学未来食品科学中心/生物工程学院，江苏无锡214122)
摘要：通过剖析中国传统发酵食品的种类和研究现状，结合中国传统发酵食品生产过程，包括发酵工艺、复杂环境、混菌体系、感官评定等技术特点，进一步挖掘中国传统发酵食品的前沿应用技术，如人工感知技术的应用、发酵食品微生物新技术的应用、发酵食品感知新技术的应用等。探讨将基因工程、合成生物学、分子生物学、神经生物学等前沿生物技术应用于中国传统发酵食品的生产中，通过对微生物的筛选与改造使发酵过程更智能、可控。并基于人体感官及大数据，建立感知新技术(如基于神经生物学的发酵调控、基于大数据的风味网络技术等)，进而从风味、营养、安全、稳定性等方面促使中国传统发酵产品更美味、更健康、更安全。未来，应以改善中国传统发酵食品为抓手，进一步加速开发发酵食品的关键共性技术、现代工程技术、前沿引领技术和颠覆性技术，推动我国整体食品发酵产业的创新式发展，引领世界食品发酵产业的发展迭代。
关键词：中国发酵食品；发酵工艺；人工感知；神经生物学；前沿技术
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
doi:10.12301/j.issn.2095-6002.2021.02.001
引用格式：陈坚，汪超，朱琪，等.中国传统发酵食品研究现状及前沿应用技术展望[J].食品科学技术学报，2021,39(2):1-7.
CHENJian，WANGChao，ZHUQi，etal.ResearchstatusandapplicationprospectoffrontiertechnologyoftraditionalfermentedfoodinChina[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2021,39(2):1-7.
收稿日期：2020-12-18
基金项目：科技部农村司咨询项目(食品工业科技发展情况研究)；中国工程院咨询研究项目(天津市振兴老字号食品产业创新发展战略研究)。
第一作者：陈坚，男，中国工程院院士，教授,博士生导师,主要从事生物发酵产业方面的研究。
将基因工程、合成生物学、分子生物学等前沿生物技术应用于传统发酵食品的生产中，能有效地定向改良发酵食品的风味感官，增加其营养成分以及消除抗营养分子，同时能维持发酵食品品质的长期稳定性。例如应用合成生物学使工业酿酒酵母合成单萜分子芳樟醇和香叶醇，在啤酒中形成更令人愉悦的啤酒花风味，而不用添加啤酒花[23]。
随着感知科学基础研究的快速发展，如酸味受体被鉴定，同时确定了酸甜苦咸鲜5种味道的神经元结构[24]，研究表明：酸味使用舌头专用的味觉受体细胞(TRC)，以精细调节大脑中的味觉神经元触发厌恶行为，使得人工感知器官可能被实现模拟和应用。
虽然人工智能技术进行风味物质的挖掘、组合，实现人工感知器官(电子眼、电子鼻、电子舌)模拟研究还处于初级阶段。只能实现对现有产品有效分类，但无法指出样品间的物质、感官差异。但技术的迭代日新月异，不久的将来人工感知器官将得到更加广泛的应用。如同生物传感器的发展经历了从“酶电极”“酶、免疫、微生物传感器”“细胞传感器”“组织传感器”“生物芯片”到“多功能传感器”的演变。
运用智能感官等技术进行食物感知、物质分析、仿生传感、感官评价、消费者分析。如运用计算机视觉模仿视觉观察食物外观特征，运用电子鼻模仿人体嗅觉器官嗅出食物香味，应用机械嘴模拟吃食物过程，应用机械触觉模拟手指触觉，对食物软硬度流动性等质构情况提供信息等技术。通过数据学习、训练，输出食品的多感官特性描述，如产品的消费者情感影响、产品与消费者目标差异等。
随着一批将对生物技术产业产生巨大影响的技术出现与高速发展，我们能结合多元化的手段对关键发酵微生物进行定向化筛选与改造，获得传统方法难以筛选到的功能微生物，包括不可培养的功能微生物，编辑关键微生物遗传信息，创建全新的、高效的微生物群落，从而赋予整个微生物细胞工厂更高的发酵智慧。例如，可使微生物拥有原料自识别和高利用能力、风味物质代谢的适度自控、营养物质高积累和抗营养因子生物降解能力，以及复杂环境自适应和不良条件的强抵御能力等。
3.2.1微生物的快速精确定量技术
表1发酵食品微生物绝对定量技术Tab.1Absolutequantificationmethodsofmicroorganismsinfermentedfood
3.2.1.1EMA/PMA-qPCR技术
实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。魏娜等[25]利用qPCR对浓香型白酒不同窖龄窖泥微生物区系特定种群的快速定量检测，再进一步结合代谢产物指标可用于窖池中难培养微生物种群的功能分析和评定；李凤珠等[26]基于qPCR建立一种准确定量榨菜腌制过程中细菌和真菌数量的方法。
但普通的qPCR只能反应目标微生物总的拷贝数，无法区分死、活微生物的数量。EMA/PMA-qPCR活菌检测技术是利用新型核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidiummonoazide，EMA)或叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)渗入膜损伤的细胞后，与双链DNA或RNA发生非可逆的共价结合，从而抑制膜损伤细胞DNA在PCR反应中的扩增，使qPCR反应结果只反映活细胞DNA含量[27]。盖冬雪[28]采用PMA-qPCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量,分别建立一种快速检测巴氏乳中细菌与发酵乳中酵母菌活菌总数的检测方法。段亮杰等[29]利用PMA-qPCR法快速、准确地检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数，为解析样品中乳杆菌的实时组成及检测具有活性但不可培养(viablebutnonculturable，VBNC)状态的乳杆菌提供了可靠的手段。Lü等[30]对与红曲糯米酒传统酿造有关的主要微生物的PMA-qPCR参数进行了标准化并成功将优化的PMA-qPCR方法应用于红曲糯米酒的传统酿造过程中总细菌，总真菌，酵母菌，酿酒酵母和植物乳杆菌等微生物数量的监测。
3.2.1.2流式细胞术
流式细胞术(flowcytometry)是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪(flowcytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征及根据这些物理化学特征精确分选细胞的技术，主要包括流式分析与流式分选两部分[31]。它可以高速分析上万个细胞，速度快、精度高、准确性好，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。近年来，流式细胞术被广泛应用于食品微生物的检测。黄韵[27]采用流式细胞术对冷鲜肉中的具有VBNC状态的单增李斯特菌进行定量检测，经研究发现，流式细胞术相对于平板计数法和PMA-qPCR定量能够更加快速且精准地检测食品中的致病菌。Malacrino等[32]利用流式细胞术对葡萄酒中的酵母与苹果酸-乳酸菌同时进行快速有效的定量。Conacher等[33]通过流式细胞术对合成酵母菌群系统中微生物数量的动态变化进行实时监控。
3.2.1.3CRISPR-Cas12a耦合荧光探针系统
随着分子技术的发展，出现了一批新兴方法，例如基于CRISPR-Cas12a耦合荧光探针系统，可实现快速、简便、准确的特异性微生物定量[34]，在食品微生物检测方面有着巨大的潜力。通过优化荧光强度响应的动态范围，强化微生物种类检测的特异性，开发微生物检测试纸，食品微生物检测有望实现实时定量快速检测，为混菌发酵过程监控与食品安全检测提供有力工具[35]。
3.2.2人工合成技术
传统发酵食品中的原生混菌系统具有复杂、稳定性差和功能冗余等缺陷，会造成原料转化的低效和不良副产物的生成，同时也会增加发酵产品品质和风味的波动性。实现功能菌群的人工合成(组装与调控)，将有助于解决风味、安全与健康等问题。
3.2.2.1人工重组菌群
人工重组菌群有助于在模拟环境中实现传统发酵食品风味的重现。为实现人工菌群的选择与重组，首先需要在多组学联用分析研究的基础上，探究传统发酵食品的微生物群落结构及其演替规律，通过酶系、菌系和物系间的互作关系解析核心功能菌群。在此基础上，评估影响菌群的生物因子与非生物因子，并通过模拟发酵分析重组菌群的最佳结构比例[36]。Wang等[4]运用扩增子测序技术结合代谢组学技术解析白酒发酵过程中的核心微生物菌群，并通过人工合成菌群重现白酒发酵，这对发酵食品的可操作性和连续性生产具有重要意义。
3.2.2.2人工调控菌群
通过添加功能微生物调整菌群结构，可以使其拥有更强的原料转化效率、风味合成能力以及有害物质的降解能力[37]。传统生态系统中具有微生物演替和环境变量的自然发酵，导致发酵食品品质存在波动性。He等[6]提出了定向微生物扰动，用于食品发酵中微生物群的调控和目标产物的增加。通过接种Bacillusvelezensis和Bacillussubtilis调整大曲菌群结构来强化大曲功能。结果表明：强化大曲的生物扰动明显影响了微生物群落，增加了己酸菌、梭菌、曲霉、念珠菌、甲烷菌和甲烷菌的丰度，降低了乳酸杆菌的丰度。共现分析表明：生物扰动增加了微生态系统中物种间相互作用的多样性和复杂性，从而促进了风味代谢产物(如己酸，己酸乙酯和己酸己酯)的生成。这些结果表明：通过功能菌群的种间相互作用，强化大曲的生物扰动对于风味代谢的促进是可行的[38]。人工调控菌群对于提升中国白酒以及其他发酵食品的品质至关重要。
深入探索发酵食品感知技术，研究食品的感官特性和消费者的感觉，探究感官交互作用和味觉多元性，解析大脑处理化学和物理刺激过程从而实现感官模拟，理解感官的个体差异，多学科交叉进行消费者行为分析，评估感官、消费者的方法学[39]。构建“发酵+食品+神经生物学+大数据”的系统化研究体系。
3.3.1基于神经生物学的发酵调控
如找出发酵产品中风味的关键物质成分，了解其造成食用后舒适、不适的机制，确定干预措施，提升产品食用后的舒适度。构建初舒适度模型及理论，建立动物模型，确定舒适度指标。厘清舒适度的标志物和机理，开展行为学、体外脑组织培养高通量筛选技术、生化和生理学实验。进而开展人体测试、转化研究。
3.3.2基于大数据的风味网络技术
风味化合物不等于风味，不同种类和比例甚为重要；因为人工难以及时处理多类信息、实现全局优化，需要依靠大数据和人工智能技术建立风味网络；解决风味问题，优化已有风味，预测可能风味，开发新型风味及风味食品。
发酵微生物更智慧、发酵过程更智能、发酵产品更美味是新时代发酵食品技术的追求。未来，应以改善中国传统发酵食品为抓手，进一步加速开发发酵食品的关键共性技术、现代工程技术、前沿引领技术和颠覆性技术,推动我国整体食品发酵产业的创新式发展，引领世界食品发酵产业的发展迭代。
参考文献：
[1]蔡建臻.酱香型白酒的酿造工艺[J].食品界,2018(6):157.
CAIJZ.BrewingtechnologyofMaotai-flavorliquor[J].FoodIndustry,2018(6):157.
[2]孟天毅,李长文,山其木格,等.酱香强化大曲发酵过程中微生物的变化[J].酿酒科技,2015(5):65-68.
MENGTY,LICW,SHANQMG,etal.ThechangesofmicrobesinthefermentingprocessofintensifiedJiang-xiangDaqu[J].Liquor-MakingScience&Technology,2015(5):65-68.
[3]ZHENGQ,LINB,WANGY,etal.Proteomicandhigh-throughputanalysisofproteinexpressionandmicrobialdiversityofmicrobesfrom30-and300-yearpitmudsofChineseLuzhou-flavorliquor[J].FoodResearchInternational,2015,75(s):305-314.
[4]WANGSL,WUQ,NIEY,etal.Constructionofsyntheticmicrobiotaforreproducibleflavorcompoundmeta-bolisminChineselightaromatypeliquorproducedbysolidstatefermentation[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2019,85(10):e03090-e03108.
[5]GANSH,YANGF,SAHUSK,etal.DecipheringthecompositionandfunctionalprofileofthemicrobialcommunitiesinChineseMoutailiquor[J].FrontiersinMicrobiology,2019,10:1540.
[6]HEG,HUANGJ,WUC,etal.BioturbationeffectoffortifiedDaquonmicrobialcommunityandflavormetaboliteinChinesestrong-flavorliquorbrewingmicroecosystem[J].FoodResearchInternational,2019,129:108851.
[7]HEGQ,HUANGJ,ZHOURQ,etal.EffectoffortifiedDaquonthemicrobialcommunityandflavorinChinesestrong-flavorliquorbrewingprocess[J].FrontiersinMicrobiology,2019,10:56.
[8]HUY,DUNY,LIS,etal.Changesinmicrobialcommunityduringfermentationofhigh-temperatureDaquusedintheproductionofChinese‘Baiyunbian’liquor[J].JournaloftheInstituteofBrewing,2017,123(4):594-599.
[9]JINY,LID,AIM,etal.Correlationbetweenvolatileprofilesandmicrobialcommunities:ametabonomicapproachtostudyJiang-flavorliquorDaqu[J].FoodResearchInternational,2019,121:422-432.
[10]TANGH,LIANGH,SONGJ,etal.ComparisonofmicrobialcommunityandmetabolitesinspontaneousfermentationoftwotypesDaqustarterfortraditionalChinesevinegarproduction[J].JournalofBioscienceandBioengineering,2019,128(3):307-315.
[11]WANGHY,XUY.MicrobialsuccessionandmetabolitechangesduringthefermentationofChineselightaromastyleliquor[J].JournaloftheInstituteofBrewing,2019,125(1):162-170.
[12]WANGX,BANS,HUB,etal.BacterialdiversityofMoutai-flavourDaqubasedonhigh-throughputsequencingmethod[J].JournaloftheInstituteofBrewing,2017,123(1):138-143.
[13]YANGJG,DOUX,MAYY.DiversityanddynamicsuccessionofmicroorganismsduringDaqupreparationforLuzhou-flavourliquorusingsecond-generationsequencingtechnology[J].JournaloftheInstituteofBrewing,2018,124(4):498-507.
[14]HUANGZR,HONGJL,XUJX,etal.ExploringcorefunctionalmicrobiotaresponsiblefortheproductionofvolatileflavourduringthetraditionalbrewingofWuyiHongQuglutinousricewine[J].FoodMicrobiology,2018,76:487-496.
[15]NIEZ,ZHENGY,DUH,etal.DynamicsanddiversityofmicrobialcommunitysuccessionintraditionalfermentationofShanxiagedvinegar[J].FoodMicrobiology,2015,47:62-68.
[16]NIEZ,ZHENGY,WANGM,etal.Exploringmicrobialsuccessionanddiversityduringsolid-statefermentationofTianjinDuliumaturevinegar[J].BioresourceTechnology,2013,148(8):325-333.
[17]WULH,LUZM,ZHANGXJ,etal.Metagenomicsrevealsflavourmetabolicnetworkofcerealvinegarmicrobiota[J].FoodMicrobiology,2017,62:23-31.
[18]HUANGXN,YUSZ,HANBZ,etal.Bacterialcommunitysuccessionandmetabolitechangesduringsufufermentation[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2018,97:537-545.
[19]LIUZ,PENGZ,HUANGT,etal.ComparisonofbacterialdiversityintraditionallyhomemadePaocaiandChinesespicycabbage[J].BioresourceTechnology2019,83:141-149.
[20]XIAOY,XIONGT,ZHENP,etal.CorrelationbetweenmicrobiotaandflavoursinfermentationofChineseSichuanPaocai[J].FoodResearchInternational,2018,114:123-132.
[21]XIEMX,ANFY,YUEXQ,etal.CharacterizationandcomparisonofmetaproteomesintraditionalandcommercialDajiang,afermentedsoybeanpasteinnortheastChina[J].FoodChemistry,2019,301:125270.
[22]ANF,LIM,ZHAOY,etal.Metatranscriptome-basedinvestigationofflavor-producingcoremicrobiotaindifferentfermentationstagesofDajiang,atraditionalfermentedsoybeanpasteofnortheastChina[J].FoodChemistry,2020,343:128509.
[23]DENBYCM,LIRA,VUVT,etal.Industrialbrewingyeastengineeredfortheproductionofprimaryflavordeterminantsinhoppedbeer[J].NatureCommunications,2018,9(1):965.
[24]ZHANGJ,JINH,ZHANGW,etal.Soursensingfromthetonguetothebrain[J].Cell,2019,179(2):392-402.
[25]魏娜,朱晓宇,陶勇,等.浓香型白酒窖泥中优势菌群的定量PCR分析[J].应用与环境生物学报,2015,21(4):635-639.
WEIN,ZHUXY,TAOY,etal.DetectionofdominantprokaryotesinpitmudofChinesestrong-flavorliquorbasedonqPCR[J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentalBiology,2015,21(4):635-639.
[26]李凤珠,张玉礼,杨吉霞.运用实时荧光定量PCR法研究榨菜腌制过程中细菌和真菌数量变化[J].食品与发酵工业,2019,45(18):58-64.
LIFZ,ZHANGYL,YANGJX.EvaluationofquantitydynamicsofbacteriaandfungiduringcuringprocessofZhacaibyrealtimequantitativePCR[J].FoodandFermentationIndustries,2019,45(18):58-64.
[27]黄韵.冷鲜肉中单增李斯特菌活菌分子检测技术研究[D].广州：华南理工大学,2014.
HUANGY.ResearchonmoleculardetectiontechniquesofListeriamonocytogenesincoldmeat[D].Guangzhou：SouthChinaUniversityofTechnology,2014.
[28]盖冬雪.乳品中细菌与酵母菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立[D].长春：吉林大学,2016.
GAIDX.EstablishmentofPMA-qPCRmethodfordetectionofviablebacteriaandyeastindairy[D].Changchun:JilinUniversity,2016.
[29]段亮杰,沙雨婷,罗意,等.叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR法实时快速检测5种乳杆菌活菌数方法的建立与应用[J].微生物学通报,2020,47(12):4317-4327.
DUANLJ,SHAYT,LUOY,etal.QuantitativePCRcombinedwithpropidiummonoazidetreatmentforreal-timeandrapiddeterminationoffiveviableLactobacillus[J].MicrobiologyChina,2020,47(12):4317-4327.
[30]LüXC,LIY,QIUWW,etal.Developmentofpropidiummonoazidecombinedwithreal-timequantitativePCR(PMA-qPCR)assaystoquantifyviabledominantmicroorganismsresponsibleforthetraditionalbrewingofHongQuglutinousricewine[J].FoodControl,2016,66:69-78.
[31]夏天爽.流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展[J].食品安全导刊,2019(34):62-64.
XIATS.Researchprogressofflowcytometryinfoodmicrobiologicaldetection[J].ChinaFoodSafetyMagazine,2019(34):62-64.
[32]MALACRINOP,ZAPPAROLIG,TORRIANIS,etal.Rapiddetectionofviableyeastsandbacteriainwinebyflowcytometry[J].JournalofMicrobiologicalMethods,2001,45(2):127-134.
[33]CONACHERCG,NAIDOO-BLASSOPLESRK,ROSSOUWD,etal.Real-timemonitoringofpopulationdynamicsandphysicalinteractionsinasyntheticyeastecosystembyuseofmulticolourflowcytometry[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2020,104(12):5547-5562.
[34]LIF,YEQ,CHENM,etal.AnultrasensitiveCRISPR/Cas12abasedelectrochemicalbiosensorforListeriamonocytogenesdetection[J].Biosensors&Bioelectronics,2021,179:113073.
[35]RUILY,DIL,XIAOJ,etal.CRISPR-Cas9/Cas12abiotechnologyandapplicationinbacteria[J].Synthetic&SystemsBiotechnology,2018,3(3):135-149.
[36]QUNW,YANGZ,CHENGF,etal.CanwecontrolmicrobiotainspontaneousfoodfermentationChineseliquorasacaseexample[J].TrendsinFoodScience&Technology,2021,110:321-331.
[37]PENGW,QUNW,ZHIQW,etal.BacilluslicheniformisaffectsthemicrobialcommunityandmetabolicprofileinthespontaneousfermentationofDaqustarterforChineseliquormaking[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2017,250:59-67.
[38]GUIQH,YID,JUNH,etal.AlterationofmicrobialcommunityforimprovingflavorcharacterofDaqubyinoculationwithBacillusvelezensisandBacillussubtilis[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2019,111:1-8.
[39]王梅.工夫红茶自动发酵装置及品质智能感知技术研究[D].杭州：浙江大学,2017.
WANGM.Studyonautomaticfermentationdeviceandqualityintelligentsensingtechnologyofblacktea[D].Hangzhou：ZhejiangUniversity,2017.
ResearchStatusandApplicationProspectofFrontierTechnologyofTraditionalFermentedFoodinChinaCHENJian，WANGChao，ZHUQi，ZHANGJuan
(ScienceCenterforFutureFoods/SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Keywords：Chinesetraditionalfermentedfood;fermentationprocess;artificialperception;neurobiology;cutting-edgetechnology