目前批准产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(openreadingframe1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelopeprotein,E)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein,N)进行选择。不同产品的检测原理基本一致,但是其引物、探针设计存在不同,有单靶区段(ORF1ab)、双靶区段(ORF1ab、N蛋白)、三靶区段(ORF1ab、N蛋白和E蛋白)的检测和判读差别。一般检测位于病毒ORF1ab和N基因上的两个靶标,同一份标本需满足双靶标阳性或重复检测为单靶标阳性或两种标本同时满足单靶标才能确认SARS-CoV-2病毒核酸阳性。
检测流程:
检测程序需要经过五个步骤,取样、留样、保存、核酸提取、上机检测。首先根据试剂盒说明书进行样本采集,样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于RNA易降解,因此,采集样本时使用无RNA酶的拭子和无RNA酶的储存管。获得患者样本后,需尽快进行检测,如无法立即检测需要进行低温封装,并送到专门的检测机构进行检测。检测机构收到样本后,对样本进行核酸提取,核酸提取试剂应使用批准产品说明书中指定的核酸提取试剂盒。最后是荧光PCR核酸检测,也就是上机器检测,将提取物进行荧光PCR扩增反应,需要70—80分钟。
二
病毒侵入人体后,人体会产生相应的特异性抗体进行防御。免疫球蛋白是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的一类能与抗原特异性结合的血清活性成分,根据分子结构和抗原特异性的不同,将免疫球蛋白分为五类:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
酶联免疫吸附法(ELISA)
胶体金免疫层析法
是以胶体金为示踪标志物,应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术,氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金试纸,是将胶体金标记的生物大分子在PVC材质的试纸固定,留加样孔,并设检测线和质量控制线。在加样孔上加入样品后,再滴加液体介质,试纸上进行层析。根据试纸上的免疫反应发生结果,即胶体金位置是否有红色条带出现判断检测结果。
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、抗体、激素等检测。该法灵敏度高于ELISA,具有特异性强、线性范围宽、结果稳定、操作简化等特点,广泛应用于临床标本的检测。但是该方法对设备、操作、使用环境的要求比较高,使用时需要配套的化学发光仪器。
抗体检测的灵敏度和特异度:灵敏度反映诊断试验检出感染者的能力,若过低,会出现较多假阴性结果,影响疾病的诊断、干预和预后,严重可导致患者过早死亡;特异度衡量诊断试验正确判断非感染者的能力,若过低,则会出现较多假阳性结果,导致医疗资源的浪费,并造成患者及群众的焦虑和恐慌。因此,具有较高灵敏度和特异度是抗体检测技术的应用基础。
三
与抗体血清学检测相比,核酸检测能够检测到处于窗口期的患者,及早发现感染者,是新型冠状病毒检测的“金标准”,但是对检测设备或平台要求较高,高灵敏度的RT-PCR仪价格昂贵,对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外,核酸检测耗时较长,考虑到样本运输、样本积压的情况,通常最快24小时才可以报告结果。