3.透明带打孔的常规方法有：机械法、Tyrodes酸法和激光法。激光法鉴于其便捷、快速、高效，目前更为常用。机械法和激光法打孔可用于受精前的极体活检。囊胚活检的透明带打孔可以在受精后第3日、第5日、活检前4h或活检时进行。
1.建议：PGT-M可分为检测前的验证和临床检测两部分，具体如下。
（1）检测前验证的建议：
①建议对原始的分子遗传报告中的检测信息（如致病基因、致病变异位点、致病性以及报告中所提供的基因参考序列等）进行确认［30］。
②建议明确疾病遗传方式，采集家系成员的样本，确保胚胎检测的可靠性。同时验证遗传变异在家系中的共分离符合度，以确认报告中致病基因的准确性。
③建议采用携带者或患者的外周血淋巴细胞或口腔颊黏膜等，进行单个/较少细胞水平检测方案的可行性和有效性验证。
④建议寻找并确定有效的遗传标记，如短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR）和单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），建立双亲单体型分型，从而制定相应的临床检测策略。
（2）临床检测的建议：①建议PGT-M临床检测应同时进行基因致病变异位点的直接检测和遗传多态位点（STR或SNP）的连锁分析，以避免因扩增失败、等位基因脱扣（alleledrop-out，ADO）等因素所导致的诊断不明［31］。②建议对于致病变异位点的连锁分析，推荐在相应致病基因上下游1Mb内，各选择不少于2个可用的SNP和/或STR位点用于分析。位点的选择应避免同源性高、GC含量高或有多聚核苷酸的序列。对于家系成员不全的情况，可以利用携带致病突变的极体或者单个精子或胚胎作为连锁分析的依据。③建议在进行遗传连锁分析时，特别注意致病变异附近的基因组重组情况。④建议采用PGT-M联合胚胎染色体非整倍体检测（PGTforaneuploidies，PGT-A）的检测策略［32-33］。
2.PGT-M的检测方法：因PGT-M胚胎活检细胞样本稀少，在进行下游遗传学检测前建议先进行扩增，以获得充足的DNA样本满足拟采用的检测策略。目前PGT-M技术中常用的胚胎DNA扩增方式为单细胞全基因组扩增（whole-genomeamplification，WGA）［34］。
（1）WGA：WGA是对单个细胞或少量细胞进行全基因组扩增的技术。其目的是在尽量减少基因序列偏好性的前提下大幅度地增加DNA的总量，获得基因组高覆盖率的完整的扩增产物。目前常用的WGA技术主要有多重置换扩增（multipledisplacementamplification，MDA）［35］、多次退火环状循环扩增（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles，MALBAC）［36］和简并寡核苷酸引物PCR（degenerateoligonucleotide-primedpolymerasechainreaction，DOP-PCR）等。
①MDA：MDA方法扩增产物为10~100kb的DNA片段，复制的保真性强，基因组覆盖度高，在对单核苷酸变异（singlenucleotidevariant，SNV）的分析以及构建大片段文库上有着显著优势。但MDA存在扩增偏倚，重复性稍差，应用于拷贝数变异（copynumbervariations，CNV）检测时需进行数据校正。
②MALBAC：MALBAC基因组扩增存在一定可重复的序列偏好性，会造成基因组低覆盖区CNV诊断偏倚，可经过数据分析后进行CNV校正。
③DOP-PCR：由于PCR指数扩增，任何扩增过程中的细微偏差都会被放大，扩增产物的覆盖度较低［37］。
作者：中国医师协会生殖医学专业委员会，中国医师协会医学遗传医师分会
责任编辑：暖暖
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