刘健，白艺兰，李鑫，桂亚萍，鞠厚斌，龚国华，夏炉明，陈伟锋，朱晓英，常晓静，李增强，唐聪圣，王建，赵洪进
(上海市动物疫病预防控制中心，上海201103)
猫杯状病毒(felinecalicivirus，FCV)属于杯状病毒科、水疱疹病毒属，是一种引起猫科动物口腔与上呼吸道疾病的重要病原。FCV呈世界性分布，在猫科动物中具有高度传染性，猫及老虎、猎豹等野生猫科动物均易感。FCV主要临床症状表现为鼻炎、结膜炎、急性口腔溃、肺炎、慢性胃炎和跛行等。近年来，由于FCV高度的变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性全身性疾病，死亡率高达50%，症状可表现为溃疡性皮炎、急性关节炎、肠炎、流产以及跛行等全身感染，对猫及猫科动物造成严重威胁。
FCV全基因组由3个开放性阅读框(openreadingframe，ORF)组成，其中，ORF2基因编码结构蛋白1，按功能域ORF2又可划分为A、B、C、D、E和F6个区。C和E区变异性较大，特别是E区包含鉴别VS-FCV的特征性氨基酸突变位点，变异最为明显，也是早期疫苗免疫失败的重要原因。为了进一步了解FCV在上海地区流行状况及其遗传变异和演化方向，本研究从2021年1月—3月，从上海地区上呼吸道症状猫的病料中分离鉴定得到13株FCV，对其1基因进行遗传演化分析，丰富了国内FCV分离株的基础数据，也为该病毒强毒株的筛选和疫苗研究提供参考依据。
从上海市中心城区宠物医院收集了17份具有上呼吸道症状患猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子样品，记录患猫的年龄、猫三联灭活疫苗免疫情况、主要临床症状(表1)。将采集的拭子加2mLPBS缓冲液浸泡后，用0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃保存备用。
表1临床样品采集的详细信息Table1Detailsoftheclinicalsamples
F81细胞(猫肾传代细胞)由上海市动物疫病预防控制中心兽医实验室保存。猫三联灭活疫苗(猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症)(批号：D286389A)购自硕腾(上海)企业管理有限公司；DMEM细胞培养液(批号：2126865)、0.25%浓度胰酶消化液(批号：2042303)均购自GIBCO公司；胎牛血清(批号：2418)购自Sigma公司；核酸提取试剂盒(批号：MDII14-01)购自Magen公司；PrimeScriptRT-PCRKit(批号：AJ62323A)、LAPCRKitVer.2.1(批号：AK5301)、PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2(DyePlus)(批号：AKE0559A)购自宝生物工程(大连)公司；猫疱疹病毒1型荧光PCR检测试剂盒(批号：FHV20210504)、猫细小病毒荧光PCR检测试剂盒(批号：FPV20210604)购自上海尔创生物科技有限公司。
吸取50μL上述处理的样品，猫三联灭活疫苗作阳性对照，阴性拭子作阴性对照，提取总RNA，依据参照文献[6]合成引物：上游引物FCV-JCF：5′-GCCTCAAACATTAGGAGTGC-3′；下游引物FCV-JCR：5′-CCCTGGGGTTAGGCGCAG-3′，扩增片段为420bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照文献[6]的方法进行RT-PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳分析，将出现预期目的片段的RT-PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果用NCBI中的BLAST工具进行比对分析，确认是否为FCV基因序列。同时将FCV阳性的样本接种F81细胞，进行病毒的分离培养。
F81细胞常规消化传代，待长成单层且贴壁率达到90%时，将细胞按照1∶3的比例消化传代，同时将上述病料同步接种到细胞中，37℃，5%CO浓度培养箱中培养，每6h观察细胞病变1次，70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，将培养液冻融3次，收集细胞上清。
1.5.1FCV1基因的扩增依据参考文献[4]合成FCV1基因全长扩增引物，FCV-VP1上游引物：5′-ATGTGCTCAACCTGCGC-3′；FCV-VP1下游引物：5′-TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT-3′。FCV1基因序列全长2007～2010bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。体系总体积为50μL：PrimeScriptRT-PCRKitbuffer25μL，EnzymeMix2μL，上、下游引物(浓度均为10μmol·L)各1μL，RNA模板1μL，双蒸水补至50μL。反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μLRT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性RT-PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序结果用NCBI中的BLAST工具进行比对分析，确认是否为FCV的1基因序列。
1.5.2形态学鉴定将分离病毒株第3代培养物接种F81细胞，待70%细胞出现CPE后反复冻融3次收毒，将收获的细胞液冻融3次后，10000r·min离心1h，除去细胞碎片，随后上清液与终浓度为10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合过夜。在4℃下12000r·min离心2h后，用Tris缓冲盐溶液(TBS)重悬，经2%磷钨酸负染后进行透射电镜观察。
1.5.3外源病毒检测对13株分离株进行猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫细小病毒(FPV)两种外源病毒检测。根据猫疱疹病毒1型荧光PCR检测试剂盒和猫细小病毒荧光PCR检测试剂盒要求，对分离病毒株第3代培养物进行FHV-1和FPV荧光PCR检测。
分别参照国内外FCV强毒株、经典株和疫苗株1基因序列(表2)，利用MEGA6.0和DNAStarv7.1软件构建FCV1基因遗传演化分析树，并分析其序列特征。
表2FCVVP1参考序列Table2ReferencestrainsofFCVVP1gene
1.7.1分离株有限稀释纯化将FCV-SH202101和FCV-SH202113分离病毒株第3代培养物用细胞培养液进行10倍的倍比稀释，共稀释11个稀释度，将稀释液与消化好的细胞悬液按照体积比1∶3加入至6孔板中，第12孔加细胞悬液作阴性对照，每孔体积为2mL。37℃，5%CO浓度培养箱中培养，每6h观察细胞病变1次。待70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，收获出现细胞病变的最大稀释度孔的上清进行二次有限稀释纯化，共稀释纯化6次，测定纯化后病毒液的TCID，-80℃保存备用。
1.7.2攻毒试验将6只健康中华田园猫(3只2～3月龄幼猫，3只2岁左右成年猫，均未免疫过猫三联灭活疫苗)分为A组、B组和对照组，每组均为2只，包括1只幼猫和1只成年猫。A和B组猫均采用滴鼻和口服方式分别接种10TCID·mL的FCV-SH202101和10TCID·mL的FCV-SH202113分离株病毒液，接种剂量为滴鼻和口服各1mL·只；对照组猫接种相同剂量的DMEM细胞培养液。不同感染组隔离饲养，自由采食、饮水，每日监测猫的临床症状和死亡情况，同时采集眼、口、鼻拭子用于排毒情况的检测。
17份病料经FCVRT-PCR扩增，其中，编号为BD20210104-2～BD20210104-8、BD20210112-1、BD20210127-1、BD20210804-1、BD20210804-3～BD20210804-5的13份样品扩增产物经凝胶电泳检测显示，在420bp左右出现与预期目的产物大小一致的目的条带，部分病料样品的扩增结果见图1。
M.DL2000DNA相对分子质量标准；1～4.RT-PCR阳性病料样本；5～8.RT-PCR阴性病料样本；9.阳性对照；10.阴性对照M.DL2000DNAmarker;1-4.RT-PCRpositivesamples;5-8.RT-PCRnegativesamples;9.Positivecontrol;10.Negativecontrol图1部分病料FCVRT-PCR检测结果Fig.1FCVRT-PCRdetectingresultsofpartsamples
将13份样品的RT-PCR产物进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析，确认13个序列均为FCV的基因序列，表明13份样品均为FCV阳性。
13份FCV阳性病料接种F81细胞，盲传3代，第3代细胞培养物接种F81细胞24h，均产生CPE，细胞出现圆缩、拉丝、聚集现象，然后脱落、漂浮在细胞维持液中(图2)。
A.接种BD20210104-2第3代细胞培养物的F81细胞；B.阴性对照A.F81cellsinoculatedthe3rdgenerationcellcultureofBD20210104-2;B.Negativecontrol图2接种BD20210104-2第3代细胞培养物24h后F81细胞病变结果Fig.2CPEofthe3rdgenerationcellcultureofBD20210104-2inF81cellsat24h
将13份病毒上清液提取RNA，进行FCV1RT-PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后得到约2000bp大小的条带，与预期2007bp大小一致(图3)。测序结果拼接后，得到13株FCV的1全基因序列，将13株病毒1基因序列在NCBI中进行BLAST比对分析，确认13株序列均为FCV的1基因序列，表明13株分离株为FCV，分别命名为FCV-SH202101～FCV-SH202113。
M.DL2000DNA相对分子质量标准；1～13.FCVVP1RT-PCR阳性产物M.DL2000DNAmarker;1-13.FCVVP1RT-PCRpositiveproducts图3FCVVP1RT-PCR结果Fig.3FCVVP1RT-PCRdetectingresults
FCV-SH202101株F81细胞第4代培养物经电镜负染观察可见无囊膜，呈圆形、椭圆形等形态，直径30～40nm的病毒粒子(图4)，与杯状病毒粒子形态特征相符，表明分离株病毒为FCV。
图4FCV-SH202101病毒粒子电镜图Fig.4ElectronmicroscopyimageofisolatedFCV-SH202101strain
对13株FCV分离株进行FHV-1和FPV两种外源病毒荧光PCR检测，结果均为阴性。
2.6.1分离株与国内外参考株1基因同源性及遗传演化分析将13株FCV分离株与国内外参考株1基因进行同源性分析。结果显示，13株上海分离株之间的核苷酸序列相似性为74.3%～99.8%，其中，FCV-SH202103株与FCV-SH202104株相似性最高，为99.8%；FCV-SH202108株与FCV-SH202111株相似性最低，为74.3%。与国内外强毒株相似性为73.8%～82.9%，其中，FCV-SH202113株与FCV-5株相似性最高，为82.9%；与国内外经典株相似性为73.4%～80.1%，氨基酸序列分析显示，FCV-SH202102株与FCV-YH-16株的相似性高达91.9%，FCV-SH202108株与FB-NJ-13株的相似性最低，为82.1%；与疫苗株相似性为73.2%～79.8%，氨基酸相似性FCV-SH202103株与F4株高达89.4%，FCV-SH202102株与F4株最低，为82.7%。
遗传演化树分析显示，13株分离株分布于3个分支，FCV-SH202108株与上海分离株SH/2014遗传关系较近，FCV-SH202103、FCV-SH202104和FCV-SH202112遗传关系较近，与国外参考株和疫苗株处于同一分支；FCV-SH202113株与强毒株FCV-5遗传关系较近，处于同一分支；其余毒株与国内参考株处于同一分支，且FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202106、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110遗传关系较近(图5)。
▲表示分离毒株▲standsforisolatedstrain图5分离株与参考株VP1基因序列遗传演化树Fig.5Maximum-likelihoodtreebasedonVP1geneofisolatedstrainsandreferencestrains
2.6.2VS-FCV特征性氨基酸分析以部分E区(426—461aa)分析的具有VS-FCV突变特征氨基酸位点为依据，确定430、438、443、448、452、455和458为VS-FCV特征性氨基酸位点(图6)。结果表明5株分离株与VS-FCV有6个位点吻合，7株分离株有5个位点吻合，1株分离株有4个位点吻合(表3)。
表3FCVVP1蛋白部分E区强毒株特征性氨基酸位点分析Table3VS-FCVcharacteristicaminoacidsitesanalysisofparticalEregioninVP1protein
图6VP1蛋白部分E区的氨基酸比较图Fig.6ComparisonofaminoacidsequencesofparticalEregioninVP1protein
2.7.1病毒液TCID的测定测定FCV-SH202101株和FCV-SH202113株细胞半数感染量分别为10和10TCID·mL。
2.7.2感染猫的临床症状FCV202101株和FCV2021131株感染中华田园猫后，48h内幼猫陆续出现杯状病毒上呼吸道症状，如眼屎增多、气喘、咳嗽等，体温最高升至39.5℃，5d后幼猫均濒临死亡。A组成年猫1周后出现眼屎增多现象，11d后猫濒临死亡；B组成年猫1周后无明显的临床症状，2周后出现临床症状，精神沉郁、不食、发烧、眼屎大量增多，18d后死亡。
2.7.3感染猫的排毒情况每日采集不同感染组猫的眼、鼻、口拭子，利用RT-PCR方法检测其排毒情况(表4)，结果表明，FCV202101株和FCV2021131株感染猫3d后，可持续从眼、鼻、口拭子中检测到FCV。
表4猫感染FCV后排毒情况Table4VirussheddingofcatsafterFCVinfection
2.7.4感染猫的发病与死亡情况FCV202015株和FCV202031株感染猫后，均可导致试验猫的发病和死亡(图7)，对幼猫具有较强的致死性，且病程短、发病急，对成年猫也具有致死性，但病程长短不一。
图7试验组猫感染FCV后存活率Fig.7SurvivalrateofcatsafterFCVinfection
近年来，随着国民生活水平的逐步提高，上海市猫宠呈逐年上升趋势，已逐渐成为宠物市场的主流。在猫的传染病病例中，猫杯状病毒感染病例占1/3以上。本研究对17例呼吸道症状的猫病例进行猫杯状病毒的分离，经过细胞病变、1测序、病毒电镜观察，13株分离株都鉴定为FCV，阳性率达到76.47%，与周孟云等在杭州宠物猫中调查的结果基本一致，表明上海市具有呼吸道症状的宠物猫杯状病毒感染比较普遍。
由于FCV的RNA聚合酶缺乏校正功能，导致其基因组频繁变异，当出现VS-FCV时，就可能导致疫苗失去保护力。美国的Pedersen等首次报道在1998年采集的样品中发现了VS-FCV，2003年英国及2009年法国也暴发过疫苗免疫的成年猫感染VS-FCV，2013年Velasco等报道了西班牙暴发VS-FCV，2018年郭慧敏等首次报道了VS-FCV在我国流行。上海地区13株FCV分离株之间的1核苷酸序列相似性为74.3%～99.8%，与国内外参考株的核苷酸序列相似性为73.2%～80.1%，氨基酸相似性82.7%～91.9%，其中与疫苗株的核苷酸相似性只有73.2%～79.8%，氨基酸的相似性为82.7%～89.4%，分离株1核苷酸序列和氨基酸序列相似性均不高，符合FCV易突变的特征。遗传演化树显示，2株分离株与强毒株处于同一分支，8株分离株与国内经典株处于同一分支，3株分离株与国外经典株亲缘关系较近，研究表明，上海市主要流行株可能来自国内北方地区，少数毒株来自国外，与刘春国等研究结果一致，表明上海市FCV起源于不同祖先，其遗传存在生物多样性。虽然Smith等认为FCV-F9疫苗株仍然能够预防FCV的感染，但是遗传演化树显示，本市分离株与疫苗株遗传关系较远，可能是当前疫苗对猫的免疫效果不佳的主要原因。
从采样宿主临床症状、1进化树和VS-FCV特征性氨基酸位点进行分析，选择FCV-SH202101株和FCV-SH202113株进行动物感染试验，研究表明，FCV-SH202101株和FCV-SH202113株感染中华田园猫后均可导致发病和死亡，病毒的潜伏期为1～2d，接种后第3天即可检测出排毒，不同年龄段猫的病程不一致，幼猫5d后可导致死亡，成年猫病程可持续11～18d，说明FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可能为VS-FCV中国分离株，但VS-FCV的确诊还需要进一步研究病毒复制病例各脏器FCV的分布和滴度、病理变化以及可否造成感染猫的群体性发病与死亡等。
本研究从临床呼吸道症状猫分离到13株能在F81上形成CPE的病毒，经测序和电镜观察鉴定为FCV，1序列分析表明上海地区FCV流行株主要来自国内北方地区，少数毒株来自国外地区，动物感染试验表明2株FCV具有VS-FCV致病性特征，为VS-FCV毒株的筛选提供了有力的证据，也为FCV疫苗的研究提供了技术支持。