华中科技大学同济医学院：《今幸胶囊对小鼠H22肝癌的免疫调控作用》
华中科技大学同济医学院实验部分报告：《今幸胶囊对小鼠H22肝癌的免疫调控作用》
1材料与方法
1.1样品
今幸胶囊由浙江亚克药业有限公司提供（样品批号：170601），内容物为类白色颗粒，感官检查未见异常。
1.2实验动物
C57BL/6J雄性小鼠，6周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于华中科技大学同济医学院无特定病原体（SPF）级实验动物中心，适应性喂养一周后用于实验。
1.3细胞
小鼠肝癌细胞系H22购自ATCC细胞库。
1.4主要药品、试剂
胸腺五肽（thymopentin，TP-5）、顺铂（cis-platinum，CDDP）、RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素、链霉素）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、刀豆球蛋白A（ConcanavalinA，ConA）、噻唑兰（Methylthiazolyltetrazolium,MTT）、APC标记抗小鼠CD11b抗体、PE标记抗小鼠Gr-1抗体、PE-Cy5标记抗小鼠CD3抗体、PE标记抗小鼠NK1.1抗体、PE标记抗小鼠程序性死亡分子（Programmeddeath-1，PD-1）抗体、FITC标记抗小鼠CD4抗体、PE标记抗小鼠CD8抗体、PE标记抗小鼠CD25抗体、PE标记抗小鼠F4/80抗体、PE-Cy5标记抗小鼠Foxp3抗体、FITC标记抗小鼠CD11c抗体、PE标记抗小鼠MHCII抗体、APC标记抗小鼠CD86抗体、PE标记抗小鼠TCR-β抗体、PE标记抗小鼠程序性死亡分子1配体（Programmeddeath-1ligands，PD-L1）抗体、rmGM-CSF、rmIL-4、4%多聚甲醛、MouseIL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-αELISA试剂盒。
1.5主要仪器
超净工作台、CO2培养箱、荧光倒置显微镜、高速冷冻离心机、超纯水机、电子天平、流式细胞仪、恒温振荡器、压力蒸汽灭菌锅、4℃、-20℃、-80℃冰箱、低速离心机、多功能酶标仪、电热鼓风干燥箱。
1.6实验方法
1.6.1细胞复苏和培养
H22细胞，昆明鼠腹水传代。
1.6.2小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型的建立
小鼠肝癌H22细胞株，于昆明小鼠（KM小鼠）腹腔内传代保存。腹腔种植小鼠肝癌H22细胞后的第七天（已形成腹水），将KM小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5min，无菌条件下用1ml注射器4号针头抽取腹水置于5mlEP管中。细胞计数，确定肝癌H22细胞个数，调整肝癌H22细胞浓度为107个/ml生理盐水（或PBS）。用1ml一次性注射器分别接种至6周龄雄性C57BL/6J小鼠右前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml细胞悬液（含细胞5*105个）。接种后，小鼠每天正常进食，每天观察一次，建立小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型。
1.6.3试验分组和给药方法（空白组10只，其他组每组15只）空白对照（K）组：正常鼠每天灌胃生理盐水0.2ml/只。
Model(M)组：荷瘤鼠每天灌胃生理盐水0.2ml/只。
顺铂（CDDP）组：荷瘤鼠隔天腹腔注射CDDP4.8mg/kg，连续注射三周。
今幸胶囊（Jinxing）组：荷瘤鼠每天灌胃今幸10mg/kg（前期预实验筛选出的最佳剂量，该剂量以人参皂苷Rh2计。），连续给药三周。
CDDP+胸腺五肽（TP-5）组：荷瘤鼠每天腹腔注射TP-50.01mg/kg，隔天腹腔注射CDDP4.8mg/kg，连续三周。
CDDP+Jinxing组：荷瘤鼠每天灌胃今幸10mg/kg，隔天腹腔注射CDDP4.8mg/kg，连续三周。
CDDP(1w)+TP-5(2w)组：荷瘤鼠隔天腹腔注射CDDP4.8mg/kg，给药一周，之后每天腹腔注射TP-50.01mg/kg，连续两周。
CDDP(1w)+今幸(2w)组：荷瘤鼠隔天腹腔注射CDDP4.8mg/kg，给药一周，之后每天灌胃Jinxing10mg/kg，连续两周。
1.6.4脾、胸腺、淋巴结细胞悬液制备
无菌条件下迅速取出脾脏，取部分脾组织制备脾淋巴细胞。将脾脏组织放入约含5ml无菌PBS的培养皿内，清洗三次，用胶头滴管研磨脾脏，经100目尼龙筛网过滤，收集细胞悬液于离心管中。1200r·min-1离心五分钟，加入红细胞裂解液1ml，1700r·min-1离心五分钟，再用无菌PBS洗涤细胞三遍，用RPMI-1640培养基重悬细胞。于倒置显微镜下细胞计数，细胞活力测定需＞90%，并调整细胞浓度为2*107个/ml。（胸腺、淋巴结细胞悬液制备方法相同）
1.6.5脾T、B淋巴细胞增殖
取上述脾细胞悬液适量稀释为3*106个/ml，0.1ml接种于96孔板，每份样品设3个复孔，另加100μLConA(5μg/mL)或100μLLPS(10μg/ml)分别刺激T、B淋巴细胞增殖，同时设置相应对照孔。37℃5%CO2培养箱中培养24h后，每孔加入20μLMTT(5μg/mL)，轻轻振摇后继续培养4h。取出培养板3000r·min-1离心15min，弃掉上清，每孔加入150μLDMSO充分溶解甲瓒，于490nm和570nm处用酶标仪检测OD值。
取100μL1*107个/mlPBS重悬的脾淋巴细胞悬液，NK细胞加入PE-Cy5标记的小鼠CD3抗体和PE标记的小鼠NK1.1抗体；巨噬细胞加入APC标记的小鼠CD11b抗体和PE标记的小鼠F4/80抗体；TCR加入PE-Cy5标记的小鼠CD3抗体和PE标记的小鼠TCR-β抗体；MDSC加入APC标记的小鼠CD11b抗体和PE标记的小鼠Gr-1抗体；PD-1加入PE-Cy5标记的小鼠CD3抗体和PE标记的小鼠PD-1抗体，4℃避光孵育1h，加入1mlPBS，1200r·min-1离心5min，重复一次，用300μLPBS重悬，上流式细胞仪检测细胞百分率。
1.6.7CD4+CD8+T细胞测定
研磨脾脏、胸腺和淋巴结，分别制成1*107个/ml的细胞悬液备用，用PBS
重悬。取100μL1*107个/ml脾脏、胸腺细胞悬液，均加入PE-Cy5标记的小鼠
CD3抗体、FITC标记的小鼠CD4抗体、PE标记的小鼠CD8抗体，4℃避光孵育1h，加入1mlPBS，1200r·min-1离心5min，重复一次，用300μLPBS重悬，上流式细胞仪检测细胞百分率。
1.6.8CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（RegulatoryTcells，Treg）测定
取上述浓度为1*107个/ml的脾脏、胸腺细胞悬液100μL，按说明书加入FITC标记的小鼠CD4抗体和PE标记的小鼠CD25抗体，混匀，4℃避光孵育1h。用flowcytometrystainingbuffer洗涤细胞两次，1200r·min-1离心5min。每个样本加入
fixation/permeabilization工作液800μL，4°C避光反应1h。用permeabilizationbuffer洗涤细胞两次，每次1ml，1700r·min-1离心5min。100μlpermeabilizationbuffer重悬细胞，加入PE-Cy5标记的小鼠Foxp3抗体，4°C避光反应1h。用permeabilizationbuffer洗涤细胞两次，每次1ml，1700r·min-1离心5min。300μLpermeabilizationbuffer重悬细胞，上流式细胞仪检测。
1.6.9树突状细胞（Dendriticcells，DCs）的分离和培养
取每只小鼠的胫骨和股骨，洗净并分离骨髓，100目尼龙网过滤去除杂质，用无菌PBS清洗后得到骨髓细胞悬液；加入1ml红细胞裂解液，避光反应2min，加3mlPBS终止，再用3mlPBS清洗一遍，计数板计数，用RPMI-1640培养基调整细胞浓度约为2*106个/ml。取2ml细胞悬液加入6孔培养板中，再加入rmGM-CSF（20ng/ml）和rmIL-4（10ng/ml）细胞因子后在37℃，5%CO2培养箱中培养。每两天半换液，并在倒置显微镜下观察细胞形态、生长情况及集落的数量和大小。第七天收集细胞待用。
1.6.10DCs表面分子测定
取100μL1*107个/ml的DCs悬液（PBS悬浮），加入指定量的流式抗体：
FITC标记的小鼠CD11c抗体、PE标记的小鼠MHCII抗体、APC标记的小鼠CD86抗体、PE标记的小鼠PD-L1抗体。4℃避光孵育1h，PBS洗涤1次，1200r·min-1离心5min，重复一次，用300μLPBS重悬，上流式细胞仪检测。
1.6.11ELISA测血清细胞因子
在酶标板上分别设空白孔和待测样品孔。待测样品孔中加样品稀释液25μL，然后再加待测血清25μL，样品最终稀释度为2.5倍。用封板膜封板后置37℃孵育30min。揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，重复5次。每孔加酶标试剂50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min，洗板5次。每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。每孔加入终止液50μL，于450nm处用酶标仪检测OD值。
2实验结果
2.1肿瘤体积
给药组肿瘤体积均小于模型组，且肿瘤体积的增长速度更加缓慢（图1A），单一给药组，肿瘤指数均比肿瘤模型（M）组更小，联合给药组肿瘤指数减小更加明显（图1B），提示Jinxing抑癌作用明显，且与化疗药CDDP联合应用时，抑癌效果更为显著。
2.2小鼠体重，死亡率
CDDP在发挥抑癌作用的同时，副作用也非常明显。实验中CDDP组及CDDP与TP-5和今幸联合给药组（CDDP+TP-5、CDDP+Jinxing、CDDP(1w)+TP-5(2w)、
CDDP(1w)+今幸(2w)），小鼠状态很差，精神不振，蜷缩少动，从给药开始体重下降明显（图1A），并且出现不同程度的死亡。其中，CDDP组死亡率最高，4组联合给药组死亡率其次，今幸组的死亡率明显低于其他组（图2B）。今幸组小鼠从给药后体重虽然增长很慢，但并未下降，只是在疾病后期体重才开始逐渐下降。结合上部分结果，提示今幸与CDDP联合用药时，能发挥明显的抑癌作用，同时也能明显降低死亡率。
2.3血清中细胞因子
IL-10是一种主要由效应T细胞产生的抗炎细胞因子，早期被认为具有免疫抑制作用，近年的研究表明IL-10也可促进机体免疫反应，可活化T细胞和NK细胞。M组IL-10的含量显著低于K组，给药后今幸组、TP-5组和CDDP(1w)+TP-5(2w)组明显升高（图3）。提示今幸可促进血清中IL-10分泌。
图3为血清中IL-10的水平。（#表示与空白组比较，*表示与模型组比较；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，#P同*P。（下同）
2.4CD4+T细胞、CD8+T细胞
模型组与空白对照组相比，脾脏和胸腺中的CD4+T细胞CD8+T细胞比例都下降，给药后出现不同程度地上升：
CD4+T细胞（脾脏）（图4A）：今幸组高于CDDP组，CDDP(1w)+今幸(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组；
CD4+T细胞（胸腺）（图4C）：今幸组高于CDDP组；
CD8+T细胞（脾脏）（图4B）：今幸组高于CDDP组，CDDP+今幸组高于CDDP+TP-5组，CDDP(1w)+今幸(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组；
CD8+T细胞（胸腺）（图4D）：今幸组高于CDDP组。
结果提示单用一种药物时，今幸能通过上调脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，发挥免疫增强作用。联合用药时，先用化疗药，再用Jinxing效果更好，且对CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激能力强于CDDP(1w)+TP-5(2w)。（实验中也检测了胸腺中联合用药组的CD4+T细胞和CD8+T细胞比例，但效果不明显，图略。）
图4脾脏、胸腺中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例。A为脾脏中CD4+T细胞的比例。
B为脾脏中CD8+T细胞的比例。C为胸腺中CD4+T细胞的比例。D为胸腺中CD8+T细胞的比例。
2.5脾脏中NK细胞
模型组NK细胞比例低于正常组，给药后比例均上升。今幸组高于CDDP组，CDDP(1w)+今幸(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组，CDDP+今幸组高于CDDP+TP-5组。结果提示，单用今幸或先用CDDP再用今幸都能促进NK细胞增殖，增强免疫，今幸与化疗药CDDP同时使用效果不明显。
2.6脾脏中免疫抑制细胞
MDSC（图6A）：模型组MDSC比例高于空白对照组，给药后除CDDP组和CDDP+TP-5组外，其他组均下降。CDDP+J今幸组下降程度最大，其次为今幸组、CDDP(1w)+今幸(2w)组。提示今幸单用或与CDDP联合用药都能下调脾脏中的MDSC，发挥免疫增强作用。
Tregs（图6B）：与空白组相比，模型组、CDDP组和今幸组Treg比例稍低于空白对照组。提示单用今幸能下调Treg，发挥免疫增强作用。
图6脾脏中MDSC和Treg的比例。A为脾脏中MDSC的比例。B为脾脏中Treg的比例。
2.7脾脏中TCR
脾脏中模型组TCR比例低于空白对照组，给药后除CDDP组，TCR比例都上调。今幸组高于CDDP组，CDDP(1w)+Jinxing(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组，CDDP+今幸组高于CDDP+TP-5组，说明Jinxing对脾脏中的TCR有明显的上调作用，且与CDDP联合用药时效果强于TP-5。
DCs表型MHCII（图8B）：模型组MHCII比例低于空白对照组，给药后比例均上调。今幸组高于CDDP组，CDDP+今幸组高于CDDP+TP-5组，CDDP(1w)+今幸(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组，提示今幸对MHCII分子有明显的上调作用，且联合用药时效果强于TP-5。
脾脏中PD-1/DCs表面PD-L1（图8C、8D）：模型组脾脏表面的PD-1分子比例高于空白组，Jinxing组低于CDDP组，CDDP+Jinxing组高于CDDP+TP-5组，CDDP(1w)+今幸(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组。模型组DCs表面的PD-L1分子表达较空白组高，今幸组低于CDDP组，CDDP+今幸组低于CDDP+TP-5组，CDDP(1w)+今幸(2w)组高于CDDP(1w)+TP-5(2w)组，由于PD-1与PD-L1结合发挥免疫抑制作用，因此结果提示今幸单用能同时下调脾脏表面的PD-1分子和DCs表面的PD-L1分子，发挥免疫增强的作用。
3实验结论
图8DCs的表面分子比例。A为DCs表面共刺激分子CD86。B为DCs表型MHCII。C为脾脏表面PD1分子。D为DCs表面PD-L1分子。
研究结果表明：
1、今幸胶囊与化疗药CDDP联合用药具有明显的抑癌作用。
2、今幸胶囊没有明显副作用，在治疗过程中基本能稳定小鼠的体重，使小鼠保持较好的生理状态。而化疗药CDDP虽然抑癌明显，但副作用很大，小鼠体重下降明显，死亡率很高，今幸胶囊与CDDP联合用药后能降低小鼠死亡率。
3、今幸胶囊能增加脾脏、胸腺中的CD4+T细胞和CD8+T细胞，NK细胞和TCR，降低脾脏中MDSC和Treg细胞，促进DCs表面CD86和MHCII分子表达，促进DCs的成熟，降低PD-1与PD-L1，发挥免疫增强作用。与CDDP联合用药时，今幸胶囊与免疫增强剂TP-5相比，今幸胶囊对脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞、TCR的上调作用，对DCs表面的MHCII分子的上调作用，均强于TP-5与CDDP联合用药。今幸胶囊还可促进血清中IL-10的分泌，间接调节免疫功能。
4、实验中采用今幸胶囊的剂量以人参皂苷Rh2计为10mg/kg，根据今幸胶囊中人参皂苷Rh2含量以及人和小鼠给药剂量换算，该剂量与产品说明书上日服用量基本一致。
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