细胞的迁移运动不仅是细胞进行很多重要生理活动的基础,同时也是炎症反应和肿瘤发生等病理过程中的重要步骤和关键环节。细胞迁移(cellmigration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动,是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一,是机体正常生长发育的生理过程,也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
目前人们对恶性肿瘤的研究是多方面的,从癌症的产生到转移,血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。恶性肿瘤与良性肿瘤的最大区别就在于是否可以对周遭组织进行浸润,结果是形成边界不分明的癌组织,或是进入血管转移到远端(见远端转移)。根据观察可将癌症浸润分为四步。首先癌细胞表面的粘附分子会减少,与周围的细胞彼此分离,被“解除束缚”。同时癌细胞与基底膜的粘附却会增加,这是癌细胞通过增加自身基底面层粘连蛋白(laminin)受体实现的。然后癌细胞会释放蛋白酶,用以降解细胞外基质成分,如Ⅳ型胶原酶,使基底膜受损,产生缝隙。最后是癌细胞阿米巴运动样的迁移,钻过基底膜的缝隙,到达底下的间质组织。癌细胞此后会继续用蛋白酶为自己在间质组织开路,直到血管,然后它会以同样方式进入血管,经血到转移后,又以同样方式出管。因此,癌症的形成与肿瘤细胞的迁移能力密不可分,这也成为了一个诊断和治疗癌症的一个靶点。
简介:
划痕法
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图1FGF诱导的内皮细胞层迁移。A:生长因子诱导细胞信号转导,调节迁移模块,影响内皮细胞迁
移示意图;B:实验流程;C:AlexaFluor594标记HUVEC细胞,血清培养15分钟和15小时并固定
染色的结果。D:持续观察20小时,并通过细胞迁移分析的动力学分析结果;E:不同浓度FGF处理
后细胞迁移分析结果。
图1所示为荧光染色细胞的划痕实验,图2为无标记透射光拍照及分析结果。
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图3Transwell小室模式图
Transwell小室(Transwellchamber,Transwellinsert),其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不同厂家对Tran-swell会有不同的命名,而不同型号也可有不同形状、不同大小,根据实验需要,可有不同选择。
将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
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对人肝肿瘤细胞HepG2是重要的实验细胞株,具有较强的侵袭转移能力。筛选可抑制HepG2细胞的化合物对治疗肝癌有着重要的作用。HepG2细胞消化后重悬于1%血清培养基中,种于上室,下室中为10%血清培养基。6小时后,将下室培养基更换为加入100nM化合物的完全培养基。继续培养24小时,将小室膜固定,用棉签擦去膜上表面细胞,用DAPI染色。最后使用MolecularDevices的高内涵成像分析系统ImageXpressXLS采集图像并进行分析。
图5为小室膜下层细胞的照片及分析时的蒙板图片,照片为10X物镜下采集,每个孔采集了9个视野。
通过图5的统计数据可以看出,筛选出的三个化合物对HepG2细胞的迁移能力均有显著抑制作用,Cpd1和Cpd2的抑制作用更强。
图4迁移实验原理模式图
图5Cpd1、Cpd2、Cpd3对人肝肿瘤细胞HepG2迁移能力的影响。
DA
Count
Mask
Control10nMCpd110nMCpd210nMCpd3
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Transwell小室除了可以做迁移实验,还可以应用到侵袭及趋化的研究中去。做侵袭实验时,Transwell上室的滤膜被Matri-gel(主要成分为层黏连蛋白和胶原)覆盖,细胞不能自由穿过,必须分泌水解酶,并通过变形运动才能穿过这种铺有Matrigel的滤膜,此模型为模拟体内环境而设计。而做趋化实验时,靶细胞在滤膜上面,趋化因子在下面,细胞沿着趋化因子的梯度穿过模孔。由于Transwell小室的特殊设计,使其更接近体内环境,细胞在滤膜上生长,形态和功能上都更接近体内细胞状态,是一个操作简单的实验模型。
C
ontrolCpd1
Cpd2
Cpd3
10[nM]
MigrationCellNumber图5Cpd1、Cpd2、Cpd3对人肝肿瘤细胞HepG2迁移能力抑制作用柱状图。
MolecularDevices的高内涵成像分析系统ImageXpress具有可控制温度、湿度和CO2浓度的活细胞培养装,可以实现长达7天以上的活细胞实时观察,并可以对单个细胞实时追踪,进行细胞追踪分析后,能够生成细胞移动轨迹,并能计算细胞移动的角
度、速度、移动距离等多个参数,这些参数既能生成图表,也能将数据导出。