网络药理学作为现代中医药理学研究的一个新领域，是揭示中医药配方药理机制的一种有前途的方法[9]。目前通过网络药理学的方法，已经从基础实验层面揭示了左桂丸[10]、假马齿苋[11]、白花蛇舌草[12]等中医药治疗肝癌的分子机制，有望为临床治疗肝癌提供新的治疗药物和方法。本研究使用细胞实验探讨鱼腥草治疗肝癌的效果，并通过网络药理学方法构建鱼腥草肝癌的活性成分及作用靶点网络，挖掘潜在治疗靶点并通过实验验证，以期明确鱼腥草治疗肝癌的作用机制，为临床治疗提供参考。
1、材料与方法
1.1主要材料及试剂
人源性肝癌细胞系SMMC7721、SKHep1购自武汉尚恩生物技术有限公司；青链霉素混合液（G4003100ML）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；鱼腥草提取物（JYA0516257）购自高教研（北京）科技有限公司；CCK8试剂（C0042）购自广州誉维生物科技仪器有限公司；高糖DMEM培养基（C11995500BT）购自广州辰星生物科技发展有限公司；胎牛血清（FND500）购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒（S0033S）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；结晶紫（C80521125g）购自广州可乐生物科技有限公司；RNAisoPlus(9109）购自广州市齐云生物技术有限公司；GoScriptTMReverseTranscriptionMix试剂盒（A2800）购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；2×SYBRGreenqPCRMasterMix试剂盒（B21202）购自美国Bimake生物科技有限公司；TUNEL试剂盒（RC0088）购自上海茹创生物科技有限公司；蛋白裂解液（20188）购自美国Millipore公司；山羊抗兔IgGH&L(AlexaFluor488）二抗（ab150077）、山羊抗兔IgGH&L(IRDye800CW）二抗（ab216773）、MMP9(ab92536）、BCL2(ab182858）、BAX(ab32503）抗体均购自美国Abcam公司，βactin(3700）抗体购自南京多生利生物工程有限公司。
1.2细胞培养
SMMC7721和SKHep1细胞均接种于含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞生长密度≥80%时，使用胰酶进行消化并传代，取对数生长期的肝癌细胞用于后续实验。
1.3CCK8细胞活性检测实验
1.4Transwell实验检测迁移和侵袭能力
SMMC7721细胞分别用浓度为0、10.00、20.00μg/mL的鱼腥草提取物处理，SKHep1细胞分别用浓度为0、10.00、25.00μg/mL的鱼腥草提取物处理。
迁移实验：将处于对数生长期的SMMC7721和SKHep1细胞用含上述不同浓度的鱼腥草提取物的无血清DMEM培养基重悬后，调整细胞密度为1.5×105个/mL。各取100μL加入到Transwell小室的上室；同时，下室加入1mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。24h后擦除Transwell上室滤膜上表层的细胞，结晶紫染色20min，使用普通显微镜观察并拍照，随机选取5个视野计数，使用ImageJ软件进行定量分析。侵袭实验：预先在Transwell小室的上室孵育含有0.1%基质胶的培养基4h，其余步骤同迁移实验。
1.5ROS检测试剂盒检测细胞ROS水平
使用“1.4”处理浓度的鱼腥草提取物处理SMMC7721和SKHep1细胞，调整细胞密度为3×103个/mL，培养48h后弃去上清液，PBS清洗。按ROS检测试剂盒说明书使用ROS荧光探针将细胞染色30min，用PBS洗涤细胞以去除多余探针，使用荧光显微镜观察并拍摄荧光图片，使用ImageJ软件进行定量分析。
1.6TUNEL染色检测细胞凋亡情况
以3×103个/孔的密度将SMMC7721和SKHep1细胞接种于含“1.4”处理浓度的鱼腥草提取物的DMEM培养基中，培养48h后，根据TUNEL试剂盒说明书步骤，向每孔加入500μLTUNEL染色液，置于37℃培养箱避光孵育1h。随后使用PBS充分清洗，加入1μg/mL的DAPI溶液，室温孵育10min，使用纸巾吸走残余液体，用荧光显微镜观察并拍摄荧光图片，使用ImageJ软件进行定量分析。
1.7qRTPCR检测细胞mRNA的表达水平
收集按“1.4”浓度处理的细胞，根据RNAisoPlus试剂说明书提取总RNA并测定每组RNA浓度和纯度。根据GoScriptTMReverseTranscriptionMix试剂盒说明书将RNA样本反转录生成cDNA，根据2×SYBRGreenqPCRMasterMix试剂盒说明书配置qRTPCR反应体系，以cDNA为模板使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增。反应条件：95℃预变性5min,95℃变性15s,60℃退火30s,40个循环。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计如表1。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA表达水平。
表1PCR引物序列
收集按“1.4”浓度处理的肝癌细胞，加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液进行裂解，并使用超声仪震碎。根据蛋白裂解液试剂说明书的方案提取细胞蛋白于-80℃冰箱保存。将细胞蛋白样品（每泳道10μL）于SDSPAGE凝胶中分离，随后转移到PVDF膜上。室温封闭1h，加入稀释后BCL2、BAX、βactin一抗（稀释比例均为1∶1000),4°C摇床孵育过夜。次日TBST洗涤3次，每次5min；于室温条件下与IRDye800CW二抗（稀释比例为1∶15000）孵育1h;TBST洗涤3次，每次5min；随后使用双色红外激光成像系统扫膜并使用ImageJ软件进行定量分析。
1.9细胞免疫荧光染色
收集按“1.4”浓度处理的肝癌细胞，弃去上清液，使用4%多聚甲醛孵育15min,PBS清洗后使用MMP9一抗（稀释比例为1∶200）室温孵育2h,PBS液洗涤3次后使用稀释后的AlexaFluor488二抗（稀释比例为1∶1500）室温孵育1h，洗涤后用DAPI染色10min，使用荧光显微镜观察并拍摄免疫荧光图片。
1.10网络药理学方法
1.10.1鱼腥草有效成分的筛选及靶点预测
1.10.2鱼腥草抗肝癌作用靶点的筛选
1.10.3蛋白间相互作用（PPI）网络的构建及核心靶点筛选
1.10.4GO和KEGG通路富集分析
1.11统计学方法
使用GraphPadPrism9软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1鱼腥草提取物对肝癌细胞活力、侵袭和迁移的影响
使用含不同浓度（0、0.01、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00μg/mL）的鱼腥草提取物的DMEM培养基培养SMMC7721和SKHep1细胞48h后进行CCK8实验，结果（图1A～B）显示，鱼腥草提取物为10.00μg/mL时SMMC7721和SKHep1细胞的活力都被明显抑制（均P<0.0001），且20.00μg/mL比10.00μg/mL的鱼腥草提取物对SMMC7721细胞活力的抑制作用更强（P<0.05），但20.00μg/mL和25.00μg/mL的鱼腥草提取物对SMMC7721细胞活力的影响差异无统计学意义（P>0.05），而25.00μg/mL比10.00μg/mL的鱼腥草提取物对SKHep1细胞活力的抑制作用更强（P<0.05）。因此，使用10.00、20.00μg/mL的鱼腥草提取物处理SMMC7721细胞，使用10.00、25.00μg/mL的鱼腥草提取物处理SKHep1细胞，进行后续细胞实验。
Transwell实验结果（图1C～D）显示，不同浓度的鱼腥草提取物均抑制了SMMC7721和SKHep1细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.05），其中20.00μg/mL比10.00μg/mL的鱼腥草提取物对SMMC7721细胞的侵袭能力更强（P<0.01）。
2.2鱼腥草提取物可促进肝癌细胞凋亡
ROS检测结果（图2A）显示，与未处理组相比，20.00μg/mL的鱼腥草提取物处理SMMC7721细胞后ROS水平升高（P<0.05),10.00、25.00μg/mL的鱼腥草提取物处理SKHep1细胞后ROS水平均升高（均P<0.05）。TUNEL染色实验结果（图2B～C）显示，与未处理组相比，20.00μg/mL的鱼腥草提取物可促进SMMC7721细胞凋亡（P<0.01),10.00、25.00μg/mL的鱼腥草提取物均可促进SKHep1细胞凋亡（均P<0.05）。Westernblot结果（图2D～E）显示，20.00、25.00μg/mL的鱼腥草提取物分别增加了SMMC7721和SKHep1细胞中促凋亡蛋白BAX的表达水平（均P<0.05），但不影响抗凋亡蛋白BCL2的表达水平（均P>0.05）。
2.3网络药理学筛选鱼腥草治疗肝癌的作用靶点
2.4GO和KEGG通路富集分析
将上述84个鱼腥草抗肝癌作用靶点进行GO富集分析（图4A），结果显示这些靶点主要富集在细胞迁移的积极调节、炎症反应、氧化反应、对脂多糖的反应等生物过程，主要存在于膜筏、膜的侧面、细胞质的核周区域、细胞外基质等细胞组成部分，主要涉及细胞因子受体结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合、内肽酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析结果（图4B）显示，这些靶点主要富集在癌症、TNF、IL17、PI3KAKT、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌受体激活等信号通路上。
2.5鱼腥草提取物对肝癌细胞TNFα、AKT1、TP53等基因的影响
qPCR结果显示（图5A～B），在SMMC7721细胞中，与未处理组相比，10.00、20.00μg/mL的鱼腥草提取物均降低细胞TNFα、AKT1基因的mRNA表达水平（均P<0.05），而20.00μg/mL的鱼腥草提取物则增加TP53基因的mRNA表达水平（P<0.01）；在SKHep1细胞中，与未处理组相比，10.00、25.00μg/mL的鱼腥草提取物均降低细胞TNFα、AKT1基因的mRNA表达水平（均P<0.05），但均增加TP53基因的mRNA表达水平（均P<0.01）。
图1鱼腥草提取物对肝癌细胞活力、侵袭和迁移的影响
图2鱼腥草提取物可促进肝癌细胞凋亡
图3网络药理学方法筛选鱼腥草治疗肝癌的作用靶点
图4GO和KEGG通路富集分析
图5鱼腥草提取物影响肝癌细胞中TNFα、AKT1和TP53基因的表达
3、讨论
肝癌晚期术后药物治疗易产生耐药性，对于晚期肝癌患者亟需更安全有效的治疗方案[13]。鱼腥草具有抗菌、抗癌、提高机体免疫力等作用，在临床上常被用于治疗肝炎等各种炎症[14]。本研究发现鱼腥草可抑制肝癌细胞SMMC7721和SKHep1的细胞活力、迁移能力和侵袭能力，并促进细胞凋亡。MMP9具有降解细胞外基质，促进肿瘤转移的能力[15]。BAX是经典的促凋亡蛋白。在本研究中，鱼腥草抑制了SMMC7721和SKHep1细胞中MMP9蛋白的表达，并促进BAX蛋白的表达。
综上所述，本研究发现鱼腥草可抑制肝癌细胞的细胞活力及迁移和侵袭能力，且促进肝癌细胞凋亡，其中的机制可能是鱼腥草通过调节TNF、AKT1、TP53等基因影响肝癌细胞的生物学行为。由此可推断，鱼腥草可能是一个治疗肝癌的候选药物。但后续仍需开展动物实验进一步明确鱼腥草治疗肝癌的疗效及其对预测的关键靶点及信号通路的影响，为鱼腥草治疗肝癌提供更充分的理论依据。
参考文献：
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基金资助:广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026154);
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