本发明涉及生物基因治疗领域，尤其涉及一种sgrna及其构建的慢病毒载体和应用，具体涉及一种表达crispr/cas9并靶向敲除hif-1α基因的慢病毒的构建和其联合肝脏动脉栓塞术，用于人肝脏肿瘤患者的临床治疗应用。
背景技术：
作为世界第五大恶性肿瘤，肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)的致死率在所有肿瘤中排名前三，在近几十年来hcc的治疗形势并不乐观。hcc约占原发性肝癌比例的85％到90％，数据显示2012年全球新增肝癌患者782,500例，有745,500例患者死于肝癌。目前，临床用于肝癌治疗的技术包括手术切除、原位肝移植等。研究表明50％的肝癌患者由于发现过晚，并不适合使用这些传统方法。巴塞罗纳临床分析系统(barcelonacliniclivercancerstagingsystem，bclc)指出对于hcc晚期b期并不能进行手术治疗的患者，其建议治疗使用肝脏动脉栓塞术(transarterialembolization，tae)，包括肝动脉化疗栓塞术(transarterialchemoembolization，tace)。
为此，抑制hif-1α在tae/tace术后hcc患者中的高表达有望切断肿瘤复发和发展的有效方法，成为治疗hcc的一种可靠改进途径。
技术实现要素：
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seqidno.1-3所示或与其就有至少80％同一性的核苷酸序列。
所述核苷酸序列如下：
seqidno.1(sgrna719)：cctcacacgcaaatagctga；
seqidno.2(sgrna720)：tactcatccatgtgaccatg；
seqidno.3(sgrna721)：gttatggttctcacagatga。
本发明中，通过对hif-1α进行研究，设计了sgrna并进行了优化，发现采用上述sgrna构建表达crispr/cas9实现高效敲除hif-1α基因，通过慢病毒靶向敲除hcc肝癌细胞中的hif-1α基因，实现了对肿瘤细胞生长的有效控制，包括抑制肿瘤细胞迁移与细胞侵袭，g2/m期的细胞周期停滞以及促进肿瘤细胞凋亡等，效果明显并具备显著性统计差异。
根据本发明，所述sgrna的核苷酸序列如seqidno.3所示，发明人通过验证这三个sgrna，发现其都能够对hif-1α基因实现敲除，但seqidno.3所示的核苷酸序列，即sgrna721对hif-1α基因的靶向性最高，敲除效率最高。
第二方面，本发明提供一种crisp/cas9慢病毒载体，所述慢病毒载体包含如第一方面所述的sgrna的核苷酸序列。
本发明中，所述载体可以为能够构建慢病毒载体的现有载体都是可行的，只需要将本申请的sgrna插入载体内，就可以实现本申请敲除hif-1α基因的目的，本领域技术人员可以根据需要选择载体，在此不作特殊限定，本申请选用的是常规的plenti-cas载体。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的crisp/cas9慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据hif-1α第一个外显子序列设计sgrnas；
(2)将得到的sgrnas插入plenti-cas载体中，得到所述crisp/cas9慢病毒载体。
第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第二方面所述的crisp/cas9慢病毒载体与包装辅助质粒pspax2、pmd2.g和peimax试剂共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
根据本发明，所述哺乳细胞为hek293t细胞。
第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的crisp/cas9慢病毒载体用于敲除hif-1α基因。
第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第二方面所述的慢病毒载体和/或如四方面所述的重组慢病毒。
第七方面，本发明提供如第二方面所述的慢病毒载体、如第四方面所述的重组慢病毒或如第六方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为肝脏肿瘤，优选为肝癌。
优选地，所述组合物还包括药学上接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供如第二方面所述的慢病毒载体、如第四方面所述的重组慢病毒或如第六方面所述的药物组合物用于治疗肝脏肿瘤。
根据本发明，所述重组慢病毒和/或药物组合物与手术、化学药物治疗或放射治疗中的任意一种或至少两种的组合联合使用。
根据本发明，所述手术为肝脏动脉栓塞术(tae)和/或肝动脉化疗栓塞术(tace)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的crispr/cas9慢病毒可以实现高效敲除hif-1α基因，通过慢病毒靶向敲除hcc肝癌细胞中的hif-1α基因，实现了对肿瘤细胞生长的有效控制，包括抑制肿瘤细胞迁移与细胞侵袭，g2/m期的细胞周期停滞以及促进肿瘤细胞凋亡等，效果明显并具备显著性统计差异；
(2)本发明采用了目前最高效的crispr/cas9基因编辑工具，所设计的hif-1α基因sgrna位点具有优于以往研究所报道的其他位点的基因敲除活性，首次联合tae/tace手术，用于hcc肿瘤治疗，这种基因治疗与tae/tace结合的方法较单纯使用tae/tace治疗hcc的效果更明显，其临床使用潜力更大；
附图说明
图1(a)为蛋白印记检测3位肝癌患者hcc癌旁正常肝脏组织(normal,n)及hcc癌组织(tumor,t)中hif-1α蛋白的表达情况；图1(b)为免疫组化显示1位肝癌患者hcc癌旁正常肝脏组织及hcc肝癌组织中hif-1α蛋白的表达情况；图1(c)为统计免疫组化检测20位患者癌旁正常肝脏组织及hcc癌组织中hif-1α蛋白表达差异。统计差异性分析：*，p≤0.05；
图2(a)为本发明构建的3个sgrna及plenti-cas-sgrna-egfp慢病毒表达载体示意图；图2(b)为dna凝胶电泳检测t7e1核酸内切酶试剂盒处理后的hif-1α基因敲除情况；图2(c)为蛋白印记检测构建的不同慢病感染smmc-7721细胞后在缺氧条件中hif-1α的表达情况；图2(d)慢病毒感染smmc-7721细胞后能表达gfp蛋白，moi＝2.5感染情况下，流式细胞仪检测慢病毒感染后gfp阳性表达的smmc-7721细胞比例；图2(e)qpcr检测vegf1和mdr1基因在lv-h721慢病毒感染后的smmc-7721细胞正常培养条件下mrna水平上的表达情况；图2(f)为蛋白印记检测在lv-h721慢病毒感染后smmc7721细胞正常培养条件下vegf1和mdr1蛋白的表达情况，β-actin为内参基因；图2(g)lv-h721瘤内注入小鼠hcc组织后，免疫组化检测hif-1α蛋白的表达情况及其敲除效率，统计差异性分析：*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；
图3(a)transwell实验检测hif-1α敲除对smmc7721细胞侵袭能力的影响，细胞多少显示其穿越尼龙膜的能力强弱，moi＝2.5的情况下，lv-ctrl及lv-h721慢病毒感染smmc7721细胞后，cocl2诱导的缺氧条件下培养细胞并检测其侵袭能力；图3(b)moi＝2.5的情况下，lv-ctrl及lv-h721慢病毒感染smmc7721细胞后，cocl2诱导的缺氧条件下培养细胞并检测其细胞转移能力，统计差异性分析：*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；
图4(a)为hif-1α的敲除在缺氧条件下抑制smmc-7721细胞的增殖；图4(b)为hif-1α的敲除在缺氧条件下对smmc-7721细胞周期各期的影响；图4(c)为统计hif-1α的敲除在缺氧条件下对smmc-7721的细胞g0/g1期的影响情况；图4(d)感染24小时及48小时后，hif-1α的敲除对smmc-7721细胞在缺氧条件下细胞凋亡的影响及各处理组间的统计差异，统计差异性分析：*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；
图6(a)hif-1α的敲除对smmc-7721建立的原位hcc肿瘤的血管生长抑制作用，免疫组化检测cd31的表达情况；图6(b)为免疫组化检测肿瘤组织中cd31+细胞面积在不同处理组间的统计差异；图6(c)为tunel检测hif-1α的敲除对smmc-7721建立的原位hcc肿瘤的细胞凋亡情况；图6(d)为tunel检测肿瘤组织中凋亡细胞在各组间的统计差异，统计差异性分析：*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；实验小鼠分为4组，每组为4只，ctrl组：原位肝脏肿瘤及安慰剂处理小鼠组；hal组：原位肝脏肿瘤及肝脏动脉结扎hal处理小鼠组；hal+lv-ctrl组：原位肝脏肿瘤、肝脏动脉结扎hal及对照慢病毒处理小鼠组；hal+lv-h721组：原位肝脏肿瘤、肝脏动脉结扎hal及针对hif-1α敲除的慢病毒lv-h721处理小鼠组。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1：检测hcc肿瘤组织中hif1-α的表达情况
所述检测hcc肿瘤组织中hif1-α的表达方法，包括如下步骤：
1、蛋白印记检测hcc肿瘤组织中hif1-α的表达情况
(1)样品制备：1)深圳市人民医院肝胆胰外科手术取hcc肝癌患者肿瘤及癌旁组织，液氮冻存；2)加入液氮，快速研磨，获得肿瘤及正常组织粉末，ripa裂解液裂解样品；3)4℃12000g/min离心20分钟；4)将上清转移到新管，用蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度，并记录，向每个样内加入1/5体积的5×上样缓冲液，用枪混匀后于沸水浴煮沸5min；5)4℃最大速度离心10分钟；6)上清转移至新管并分装，保存于-80℃冰箱。
(2)蛋白质印记(western-blot)鉴定hif1-α蛋白表达情况：
1)清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立于筐里晾干；
2)灌胶与上样：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶，按配方配制10％分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可，用异丙醇液封加速胶凝，室温放置30min，当观察到胶凝后，倒去异丙醇，用清水冲洗，并用吸水纸吸干净；
3)配4％的浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶，待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中；
4)取提取的蛋白样品上样，每电泳孔上样30μg，加足够的电泳液后开始准备上样，(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板)用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡，将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出，加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染)；
6)转膜：转膜前将pvdf膜在甲醇里湿润然后浸于转膜缓冲液，切去凝胶的浓缩胶，将凝胶也泡于转膜缓冲液内，将两片厚滤纸用转膜缓冲液湿润，组装转膜夹心层，从下到上依次为滤纸，pvdf膜，凝胶，滤纸，接上电源，恒流60ma转膜1小时；
7)封闭：将膜用pbst洗涤后，将膜浸泡于用pbst配制的5％的脱脂奶粉的封闭液内，4℃封闭过夜；
8)一抗杂交：将封闭好的膜用pbst洗涤干净后，将膜浸泡于用pbst配制的hif1-α和β-actin的抗体(anti-hif1-α抗体，1:1000，proteintech,#20960-i-ap；anti-β-actin抗体，1:3000，thermo,#ma1-140)杂交液内室温轻摇杂交4℃过夜；
9)洗膜：将经过一抗杂交的膜用pbst洗涤6次，每次4分钟，摇床上高速振摇洗涤；
10)二抗杂交：将洗涤好的膜浸泡于用封闭液配制的辣根过氧化物酶标记的抗兔igg-hrp(1：2000，cellsignalingtechnology,#7074)或者抗鼠igg-hrp(1：2000，cellsignalingtechnolog,#7076)的二抗杂交液内室温轻摇杂交1小时；
11)洗膜：将经过二抗杂交的膜用pbst洗涤6次，每次4分钟，摇床上高速振摇洗涤；
12)显影：化学发光(ecl法)，将试剂盒中溶液a和溶液b取0.5ml混合并加入pvdf膜并充分接触，1-2min后，蛋白显像仪(thermofisher,rockford,il,usa)显色并拍照，保存图片，结果如图1(a)所示。
从图1(a)可以看出，hcc肿瘤组织(t)中高表达hif1-α蛋白，而癌旁正常肝脏组织(n)中表达的hif1-α蛋白偏低。
2、免疫组化检测hcc肿瘤组织中hif1-α的表达情况
(1)取出上述手术后hcc肝脏肿瘤及癌旁正常组织；
(2)4％多聚甲醛固定肿瘤组织；
(3)洗涤：材料经固定后，组织中的固定液必须冲洗干净，因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察；
(4)脱水：30％、50％、70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水各40min，放入95％、100％各两次，每次20min(各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去)；
(5)透明：100％酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h(或至透明为止)，须换一次二甲苯(由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡，当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态)；
(7)包埋：将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。用于包埋的石蜡的熔点在50-60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，一般动物材料常用的石蜡熔点为52-56℃；
(8)切片、贴片；
(9)免疫组化制片与观察，本实验需要使用免疫组化dab法检测试剂盒：
1)组织切片在60℃恒温箱中烘烤2小时；2)组织切片置于二甲苯(i)中浸泡10min，更换到二甲苯(ii)后再浸泡10min；3)无水乙醇(i)中浸泡5min；4)无水乙醇(ii)中浸泡2min；5)95％乙醇中浸泡2min；6)70％乙醇中浸泡2min；7)单蒸水中浸泡2min；8)抗原修复：用0.01m柠檬酸三钠微波法修复；9)静置20min使切片恢复至室温后，三蒸水中浸泡冲洗；10)pbs洗浸泡5min；11)3％h2o2去离子水，室温静置10min，tbst洗2-3次各5min；12)滴加正常山羊血清封闭液，室温15min；13)甩去多余液体，加入hif-1α抗体(1:100,proteintech,#20960-i-ap)，4度过夜；14)tbst洗3次各3min；15)滴加辣根过氧化化物酶标记的二抗40-50μl，室温静置30min；tbst洗3次各3min；16)dab显色，在显微镜下掌握染色程度；17)pbs或自来水冲洗10min；18)苏木精复染1min左右，1％盐酸酒精分化；19)自来水冲洗10-15min；20)脱水：95％酒精10秒两次，100％酒精10秒两次，二甲苯10秒两次；21)烘片封片；22)显微镜观察并扫描获得肝脏肿瘤及正常肝脏组织中hif-1α蛋白的表达情况并统计细胞表达的统计差异，结果如图1(b)-图1(c)所示；
从图1(b)可以看出，免疫组化结果表明hcc肿瘤组织(hcc)中高表达hif1-α蛋白，而癌旁正常肝脏组织(normal)中表达的hif1-α蛋白偏低。从图1(c)统计20个hcc病人hcc组织及癌旁正常肝脏组织中hif1-α蛋白的表达情况，统计表明两者差异显著(*，p≦0.05)。
实施例2：针对hif1-α基因敲除的crispr/cas9慢病毒构建
所述crispr/cas9慢病毒构建的方法，包括如下步骤：
1、plenti-cas-sg719/sg720/sg721-egfp质粒的构建
通过在线软件(www.crispr.mit.edu)设计针对hif-1α第一个外显子序列的目的sgrnas(包括sgrna719,sgrna720和sgrna721)，设计的三个sgrnas的核苷酸序列如下：
sgrna719(seqidno.1)：cctcacacgcaaatagctga；
sgrna720(seqidno.2)：tactcatccatgtgaccatg；
sgrna721(seqidno.3)：gttatggttctcacagatga；
将目的sgrnas插入质粒plenti-cas-sgrna-egfp(genechem,上海)中并测序鉴定，构建成功plenti-cas-sg719/sg720/sg721-egfp，如图2(a)所示；
如图2(a)所示，我们针对hif-1α第一个外显子序列设计了3个不同的sgrnas，包括sgrna719,sgrna720和sgrna721。图中显示了质粒plenti-cas-sgrna-egfp基本结构。
2、重组慢病毒包装及纯化
(1)将1×107个hek293t细胞(atcc,美国)铺入15cm直径的细胞皿中。细胞使用完全培养基培养dmem(gibco)，包括10％fbs(gibco)。20μgplenti-cas-sg719/sg720/-sg721质粒，15μgpspax2、10μgpmd2.g(addgene,美国)和peimax(polysciences,美国)充分混合并加在0.5mloptimem(gibco)培养基中，再加入hek293t细胞上，加少许培养基没过细胞层；
(2)培养6小时培后，移去混合液并用完全培养基进行培养，48-h，96-h后收集上清培养液并使用0.45μm滤膜(merckmillipore,美国)过滤；
(3)上清滤液在20,000rpm超高速离心机中离心2小时(4℃)，去除上清，pbs小心收集底部lv-cas病毒颗粒(lv-h719/720/721)并保存在-80℃冰箱；
3、重组慢病毒的滴定
(1)hek293t细胞用于重组慢病毒的滴定，具体方法为qpcr法定量细胞内gfp的基因表达量，其中β-actin基因作为内参基因。具体方案为：
(1’)5×104hek293t细胞铺入24孔板中；
(2’)过夜后，将10μl浓缩的慢病毒存储液与90μl的dmem混合，将该混合液稀释10倍，依次类推稀释7个梯度。将不同浓度的慢病毒加入hek293t细胞中，每个浓度重复三个梯度。
(3’)48小时后，trizol提取细胞的总rna，rt-pcr鉴定不同浓度慢病毒感染后hek293t细胞中gfp的mrna表达水平(具体可参考文献“constructionandcharacterizationofapdcd5recombinantlentivirusvectoranditsexpressionintumorcells，doi:10.3892/or.2012.1756”方法与材料中的“detectionoftherecombinantlentiviraltiterbyreal-timepcr”部分)。
(4’)病毒滴定用引物为：
β-actin-f(seqidno.4)：5’-gtccaccgcaaatgcttcta-3’；
β-actin-r(seqidno.5)：5’-tgctgtcaccttcaccgttc-3’；
gfp-f(seqidno.6)：5'-tgcttcagccgctaccc-3'；
gfp-r(seqidno.7):5'-agttcaccttgatgccgttc-3'；
结果表明各重组病毒：lv-ctrl、lv-h719、lv-h720和lv-h721的病毒滴度分别为：3×108、5×108、3×108、5×108tu/ml。
实施例3：表达crispr/cas9的慢病毒对smmc-7721细胞及hcc肿瘤hif1-α基因的敲除
1、表达crispr/cas9的慢病毒对smmc-7721细胞的感染
(1)将3×105个smmc-7721细胞(atcc,美国)铺入6孔板中，共铺2个细胞板，细胞使用完全培养基培养dmem(gibco)，包括10％fbs(gibco)；
(2)培养8小时后，分别将lv-ctrl、lv-h719、lv-h720和lv-h721加入上清培养液中，加入polybrene(sigma)，每个样品3个重复；
(3)6-8小时后，去除上清培养基，加入新鲜培养基；在缺氧实验中，培养基中需要加入150μmcocl2(sigma)作为缺氧诱导剂；
(4)48小时后，收集细胞并取部分流式(c6，bdbiosciences)检测gfp阳性细胞表达率；
(5)采用qiaampdna血液试剂盒(qiagen)提取细胞基因组dna，经分光光度仪定量和测定浓度后，保存于-20℃，同时提取细胞总rna及总蛋白保存；
2、t7e1核酸内切酶对smmc-7721细胞中hif1-α基因敲除的鉴定
t7e1核酸内切酶错配检测试剂盒用于鉴定crispr/cas9介导的基因断裂和片段紊乱，其操作步骤参考说明书，具体来说，pcr克隆出缺陷区域的dna片段，取200ng，95℃变性5min，然后缓慢降温至35℃-37℃条件下，样品再用5u量的t7e1核酸内切酶在缓冲液(neb)中孵育处理，dna电泳并分析结果，结果如图2(b)所示；
从图2(b)可以看出，lv-h719/720/721慢病毒介导了hif-1α的基因敲除。
3、蛋白印记检测缺氧条件下lv-h719/720/721感染的smmc-7721细胞中hif1-α蛋白的表达情况
(1)样品制备：1)lv-h719/720/721感染smmc-7721细胞8小时后(moi＝2.5)，培养基中需要加入150μmcocl2(sigma)，作为缺氧诱导剂，72小时后收集细胞样品；2)加入300μl的ripa于smmc-7721细胞内，迅速用枪用力吹打混匀，放置于冰上裂解20min，期间每隔2-3min用力弹打管壁；3)4℃12000g/min离心20分钟；4)将上清转移到新管，用蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度，并记录，向每个样内加入1/4体积的5×上样缓冲液，用枪混匀后于沸水浴煮沸5min；5)4℃最大速度离心10分钟；6)上清转移至新管并分装，保存于-80℃冰箱。
(2)western-blot鉴定hif1-α蛋白在不同处理组中的表达情况：具体步骤同实施例1。
保存图片，实验结果如图2(c)所示，从图2(c)可以看出，与lv-h719/720慢病毒比较，lv-h721病毒介导的hif-1α敲除效果良好，其蛋白hif-1α表达明显下降；所以在下面的实施例中将使用lv-h721慢病毒并用于研究中。
4、trizol提取不同慢病毒处理组smmc-7721细胞的总mrna
(1)准备试剂：氯仿，异丙醇，75％乙醇(depc水配)，rnaase-free的水或0.5％sds溶液，具体为加水到rnase-free的玻璃瓶，加depc到终浓度0.01％(v/v)，过夜并高压，sds也要用处理过的depc水配置；
(2)贴壁生长的smmc-7721细胞在感染lv-h721等慢病毒感染48-h后：加1mltrizol，反复吹打(1mltrizol用于10cm2的面积，trizol不够量可能导致dna污染)，室温放置5min，以保证核蛋白复合体完全解离；
(3)每1mltrizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，颠倒混合15s，室温放置2-3min；
(4)离心15min，4℃，所述离心的转速不超过12000g；
(5)取上层水相到新管中，如分离dna或蛋白可保留有机相，每1mltrizol加0.5ml异丙醇，室温孵育10min；
(6)12000×15min，4℃，去上清，每1mltrizol至少加1ml75％乙醇，蜗旋混合，7500g×5min，4℃，去上清，短时空气干燥rna沉淀，用rnase-free的水或0.5％sds溶解；
(7)吹打数次，55-60℃孵育10min，-80℃保存；
5、lv-h721感染的smmc-7721细胞中vegf和mdr1基因mrna水平表达情况
(1)向一无rnase的pcr管内加入2μl提取的总rna，2μlm-mlv逆转录缓冲液，2μl的dntp，1μlrnasin(lifetechnology)，补加9μl无rnase的超纯水至总体积为16μl，充分混匀；
(2)取两新的无rnase的pcr管，分别标记上rt+，rt-，将上述16μl混合液平分至此两管；
(3)每管加1μlhiv-1gag的反向引物，加1μl的m-mlv反转录缓冲液(lifetechnology)至rt+管中，加1μl的无rnase的超纯水至rt-管中，混匀；
(4)42℃水域中逆转录1小时；
(5)93℃下3min失活逆转录酶；
(6)以逆转录的cdna为模板，进行pcr；
(7)pcr完成后，电泳检测；
(8)经紫外分光光度仪定量和测定浓度后，保存于-20℃；
(9)qpcr鉴定vegf1和mdr1在mrna水平的表达情况，引物为：
vegf1-f(seqidno.8)：5’-tgctctacctccaccatgcca-3’；
vegf1-r(seqidno.9)：5’-gaagatgtccaccagggtctcg-3’；
mdr1-f(seqidno.10)：5’-tgatgctgctcaagttaaaggg-3’；
mdr1-r(seqidno.11)：5’-ttgccaaccatagatgaaggatat-3’；
β-actin-f(seqidno.12)：5’-gtccaccgcaaatgcttcta-3’；
β-actin-r(seqidno.13)：5’-tgctgtcaccttcaccgttc-3；
使用qpcr试剂盒(thunderbirdsybrgreenqpcrmix,toyobo)和pcr仪(rochelightcycler384,roche)，模板dna：1:10稀释使用；
pcr程序为：变性94℃，1min；40个循环pcr：变性94℃，10s；退火58℃，10s；延伸：20s；最后延伸：10min；4℃持续维持；
数据分析使用2-δδct方法，结果如图2(d)和图2(e)所示。
从图2(d)可以看到当moi＝2.5时，lv-h721慢病感染的smmc-7721细胞表达gfp的比例达到93.6％。图2图(e)可以看出，lv‐h721病毒介导的hif-1α敲除效果良好，hif-1α蛋白控制下的vegf及mdr1基因在mrna水平都表达下调，其表达得到明显的抑制(*，p≦0.001)。
6、蛋白印记检测正常条件下lv-h721感染的smmc-7721细胞中vegf及mdr1蛋白的表达情况
(1)样品制备：1)lv-h721感染smmc-7721细胞8小时后(moi＝2.5)，加入完全培养基，72小时后收集细胞样品；2)加入300μl的ripa于smmc-7721细胞内，迅速用枪用力吹打混匀，放置于冰上裂解20min，期间每隔2-3min用力弹打管壁；3)4℃12000g/min离心20分钟；4)将上清转移到新管，用蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度，并记录，向每个样内加入1/4体积的5×上样缓冲液，用枪混匀后于沸水浴煮沸5min；5)4℃最大速度离心10分钟；6)上清转移至新管并分装，保存于-80℃冰箱。
(2)westernblot鉴定vegf及mdr1蛋白在不同处理组中的表达情况，具体步骤同实施例1。
保存图片，实验结果如图2(f)所示，从图2(f)可以看出，lv-h721病毒介导的hif-1α敲除后，其下游靶蛋白vegf及mdr1蛋白表达明显下降。
7、免疫组化检测lv-h721感染小鼠hcc肿瘤后，其肿瘤中的hif-1α蛋白表达情况
(1)lv-h721慢病毒感染小鼠hcc肿瘤：1，5×107个smmc-7721细胞皮下注入裸鼠皮下。9天后，小鼠肿瘤长大到200mm3后，瘤内注入5×107个lv-h721慢病毒，其中lv-ctrl慢病毒作为对照组注入另一组小鼠瘤内。pbs组为阴性对照组，每组4只小鼠。
(2)慢病毒感染3天后，取出肿瘤组织，固定并进行免疫组化。方法参考实施例1：免疫组化检测hcc肿瘤组织中hif1-α的表达情况。结果如图2(g)。
如图2(g)所示，lv-h721慢病毒感染smmc-7721细胞建立的小鼠hcc肿瘤后，其hif-1α蛋白表达较其它两组肿瘤的表达受到明显抑制，差异显著(***,p≦0.001)。
实施例4：hif1-α基因敲除对smmc-7721细胞迁移和侵袭的影响
1、细胞培养及cocl2诱导的缺氧条件培养
(1)smmc-7721细胞使用完全培养基培养dmem(gibco)，包括10％fbs(gibco)培养，使用cocl2来创造细胞缺氧培养条件；
(2)在本实验中，smmc-7721细胞接种在6孔板中，6-8小时后，分别使用慢病毒(lv-ctrl和lv-h721)感染或对照处理，处理8小时后，部分6孔板可用于划痕实验。部分细胞可用于transwell实验。部分细胞可种入96孔板中，换取新的完全培养基并加入150μmcocl2工作液，48-h和96-h后mtt检测细胞增殖情况。同时，感染后24-h和48-h收集处理的细胞，可进行后续操作，如细胞周期和细胞凋亡的检测。
2、transwell及细胞划痕实验
(1)transwell实验使用的是直径为6.5mm,8μm孔径的过滤膜(corning,inc.,corning,ny)，用于观察细胞的侵袭能力，将matrigel(50μldmem加入10μl,corning,#356234)凝胶加入滤膜上，37℃下2-h待其形成一层小的膜层，smmc-7721细胞感染慢病毒48-h后，1×105个smmc-7721细胞铺入上层中(无fbs，200μldmem)，滤膜下层加入20％fbs的dmem，37℃下培养24-h，滤膜上层细胞轻轻刷除，膜下层的细胞用紫罗兰(crystalviolet)染色，200×显微镜下观察，拍照并统计数量。结果如图3(a)；
(2)细胞划痕实验：3×105个smmc-7721细胞铺入6孔板中，6-8-h后，不同慢病毒处理8小时后，去除上清并用黄色枪头划出一条痕迹，使该区域没有任何细胞存在，pbs洗3遍，再加入完全培养基，24-h及48-h分别观察细胞迁移能力并拍照计算划痕距离，在缺氧实验中，不同慢病毒处理24小时后，去除上清并用黄色枪头划出一条痕迹，此时，需要加入150μmcocl2诱导缺氧培养条件，24-h及48-h分别观察细胞迁移能力并拍照计算划痕距离，结果如图3(b)所示。
从图3(a)可以看出，在缺氧条件下，transwell实验结果表明hif-1α的敲除对smmc-7721肝脏肿瘤细胞侵袭有很大的限制作用，各组间的统计差异明显(***,p≦0.001)。从图3(b)可以看出，在缺氧条件下，细胞划痕实验表明hif-1α的敲除对smmc-7721肝脏肿瘤细胞迁移有很大的限制作用，各组间的统计差异明显(***,p≦0.001)。
实施例5：hif1-α基因敲除对smmc-7721细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响
1、mtt方法检测smmc-7721细胞增殖情况
2、pi检测细胞周期
(1)3×105个细胞铺入6孔板中，每个实验组重复3孔，不同组smmc-7721细胞经慢病毒处理后，设置24h及48h；
(2)胰酶消化处理各组细胞后，使用pbs清洗两遍；
(3)70％的冷乙醇固定1-h，pbs清洗两遍；
(4)pi(pi-rnasesolution；bd)溶液避光染色15分钟，操作参考说明书；
(5)流式细胞仪(facscananalyzer，bd)检测pi荧光强度，flowjo软件分析结果，结果如图4(b)及图4(c)所示；
3、annexinv-pe、7-aad抗体检测细胞凋亡
(1)3×105个细胞铺入6孔板中，每个实验组重复3孔。不同组smmc-7721细胞经慢病毒处理后(对照组：ctrl；慢病毒对照组：lv-ctrl；慢病毒实验组：lv-h721)，培养基中150μmcocl2诱导缺氧条件，设置24h及48h；
(2)胰酶消化处理各组细胞后，使用凋亡检测试剂盒(bdbiosciences,#7026588)中annexinv-pe、7-aad抗体孵育细胞，操作参考说明书；
(3)流式细胞仪(facscananalyzer，bd)检测各荧光强度，flowjo软件分析结果，结果如图4(d)；
从图4(a)可以看出，在缺氧条件下，hif-1α的敲除对smmc-7721肝脏肿瘤细胞的增殖有很大的限制作用，48-h及96-h感染后各组间的统计差异明显(***,p≦0.001)；同时，图4(b)hif-1α的敲除使得smmc-7721细胞停留的g2/m期；图4(c)显示其g0/g1期的细胞数在hif-1α的敲除显著降低，各组间的统计差异明显(***,p≦0.001)。图4(d)表明hif-1α的敲除促使smmc-7721细胞的早期凋亡；在cocl2诱导的厌氧条件下，hif-1α诱导smmc-7721细胞的凋亡高达到28.6％，各组间的统计差异明显(***,p≦0.001)。
实施例6：慢病毒lv-h721联合hal对小鼠原位肿瘤的治疗
1、萤火虫荧光素酶基因标记的smmc-7721细胞的构建
(1)携带萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)及mcherry标记的慢病毒lv-fluc构建：构建pwpxld-mcherry-fluc质粒，并与pmd2.0及pspax2质粒在hek293t细胞中转染和构建慢病毒lv-fluc，方法同实施例2；
(2)慢病毒lv-fluc感染smmc-7721细胞(moi＝2.5)，稳定表达7天后，流式分选mcherry阳性标记细胞，扩大培养及冻存保存；
2、smmc-7721-fluc细胞建立的原位肿瘤及治疗
(1)裸鼠(balb/cnu/nu小鼠，雌性，6-8周)购于上海史莱克有限生物公司((license:scxk(hu)2007-0003，中国)，小鼠在spf级动物房操作，并按照暨南大学动物实验管理条例及广州动物伦理福利规定进行实验操作；
(2)10％水合氯醛(400mg/kg)麻醉裸鼠后，原位接种3×106个smmc-7721-fluc细胞/只、lv-ctr或lv-h721感染的smmc-7721-fluc细胞接种小鼠肝脏，缝合针(reflexwoundclips7mm，reflexskinclosuresystem，harvardapparatus)缝合伤口，7天后开展治疗实验；
(3)hcc荷瘤小鼠分4组，每组8只，具体操作为：(1)smmc-7721-fluc建立的hcc肿瘤(ctrl；n＝8),(2)smmc-7721-fluc建立的hcc肿瘤+动脉结扎(hepaticarteryligation，hal；n＝8),(3)lv-ctrl感染的smmc-7721-fluc建立的hcc肿瘤+hal(lv-ctrl+hal；n＝8),(4)lv-h721感染的smmc-7721-fluc建立的hcc肿瘤+hal(lv-h721+hal；n＝8).其中，肿瘤细胞接种小鼠肝脏，5天后，各组进行小鼠动脉结扎实验。；
(6)小鼠hal及慢病毒处理后第20天，处死小鼠并取出肿瘤组织，检测其cd31表达情况及细胞凋亡情况，结果如图5(a)-图5(d)所示；
3、肿瘤组织的获得和免疫组化检测肿瘤组织中cd31蛋白的表达情况
(1)取出上述不同处理组的原位肝脏肿瘤组织；
(2)剥离了的小鼠肿瘤，4％多聚甲醛固定肿瘤组织；
1)组织切片在60℃恒温箱中烘烤2小时；2)组织切片置于二甲苯(i)中浸泡10min，更换到二甲苯(ii)后再浸泡10min；3)无水乙醇(i)中浸泡5min；4)无水乙醇(ii)中浸泡2min；5)95％乙醇中浸泡2min；6)70％乙醇中浸泡2min；7)单蒸水中浸泡2min；8)抗原修复：用0.01m柠檬酸三钠微波法修复；9)静置20min使切片恢复至室温后，三蒸水中浸泡冲洗；10)pbs洗浸泡5min；11)3％h2o2去离子水，室温静置10min，tbst洗2-3次各5min；12)滴加正常山羊血清封闭液，室温15min；13)甩去多余液体，加入cd31抗体(1:100,cst,usa)，4度过夜；14)tbst洗3次各3min；15)滴加辣根过氧化化物酶标记的二抗40-50μl，室温静置30min；tbst洗3次各3min；16)dab显色，在显微镜下掌握染色程度；17)pbs或自来水冲洗10min；18)苏木精复染1min左右，1％盐酸酒精分化；19)自来水冲洗10-15min；20)脱水：95％酒精10秒两次，100％酒精10秒两次，二甲苯10秒两次；21)烘片封片；22)显微镜观察并扫描获得肝脏肿瘤组织中cd31蛋白的表达情况并统计细胞面积及统计差异，结果如图6(a)-图6(b)所示；
4、tunel试剂盒检测hcc肿瘤组织中细胞的凋亡情况
dna断裂位点的3’-羟基末端标记法结合组织化学方法(tunel)检测凋亡细胞，该法可以准确定位并发现凋亡发生中早期的dna断裂，使用的是promega的试剂盒(deadendtmcolorimetrictuneldab系统)：
1)用二甲苯浸洗2次，每次5min；2)用梯度乙醇(100％、95％、90％、80％、70％)各浸洗1次，每次3min；3)pbs漂洗2次；4)用蛋白酶k工作液处理组织15-30min在21-37℃或者加细胞通透液8min；5)pbs漂洗2次；6)制备tunel反应混合液，处理组用50μltdt+450μl荧光素标记的dutp液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dutp液，阳性对照组先加入100μldnasei，反应在15-25℃×10min，后面步骤同处理组；7)玻片干后，加50μltunel反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dutp液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1-h；8)pbs漂洗3次；9)可以加1滴pbs在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450-500nm，检测波长为515-565nm)；10)玻片干后加50μlconverter-pod于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min；11)pbs漂洗3次；12)在组织处加50-100μldab底物，反应15-25℃×10min；13)pbs漂洗3次；14)拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，结果如图6(c)-图6(d)所示；
tunel：细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，即凋亡细胞，每例切片计数5个高倍镜视野下的凋亡细胞数，其平均值即为该例肿瘤的凋亡细胞数；
mvd(微血管密度)：首先在低倍镜下观察每例切片中5个血管密度最高区域，然后再高倍镜下计数每个视野下的微血管数目。其平均值为该例肿瘤的mvd值；
从图6(a)可以看出，经hal处理后的肿瘤血管存在新生成的情况，cd31阳性细胞在lv-h721+hal实验组中表达量少，预示着其肿瘤内的血管生成受到明显抑制。图6(b)统计结果也表明，与其他hal处理的两组比较，cd31+细胞的面积在lv-h721+hal实验组中显著性抑制(*，p≤0.05)。同时，图6(c)tunel结果也表明，在lv-h721+hal实验组中，hcc的肿瘤组织中细胞凋亡效果明显。图6(d)统计结果表明，与其他对照组比较，lv-h721+hal实验组中肿瘤细胞凋亡率十分显著(*，p≤0.05)。