蛋白酶功能抑制对预防B.vulgatus诱导的结肠炎的功效。
编译：微科盟亭亭，编辑：微科盟小编、江舜尧。
导读
论文ID
原名：Multi-omicsanalysesoftheulcerativecolitisgutmicrobiomelinkBacteroidesvulgatusproteaseswithdiseaseseverity
期刊：NatureMicrobiology
IF：17.745
通讯作者：DavidJGonzalez，RobKnight
通讯作者单位：美国加利福尼亚大学
DOI：10.1038/s41564-021-01050-3
实验设计
结果
1实验设计
我们收集了来自单一学术性IBD中心（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）的便利生物库的患者样本，这些样本利用多组学方法通过临床疾病活动指数和内窥镜、组织学严重程度的盲法评估进行了广泛的表型分析（补充表1）。我们的结果数据代表了迄今为止关于IBD患者最广泛的多组学资源之一，利用患者匹配的血清和粪便样本进行宏基因组和16SrRNA基因扩增子测序、代谢组学、宏肽组学、血清蛋白质组学和宏蛋白质组学分析（扩展数据图1）。收集初始研究小组40份UC患者的血清和粪便样本，随后收集了第二组210份粪便样本，其中包括73例UC患者，117份CD患者（CD；大致分为回肠、回结肠和结肠亚型）和20名肠炎的志愿者。我们先前建立的共享数据库经过组装和量化后综合宏基因组-宏蛋白质组学的方法用于微生物基因和蛋白质之间的直接比较。与传统的无标记宏蛋白质组学方法相比，我们的多重化宏蛋白质组学方法的应用提供了每个样本更多的蛋白质鉴定和超过10倍的量化的蛋白质。我们通过与从人类微生物组计划的IBD多组学数据库下载的数据进行比较来证明这一重要的技术优势，人类微生物组计划的IBD多组学数据库明显小于本研究队列的患者群体（扩展数据图2）。
3分析UC患者组学和拟杆菌属上清液中的蛋白水解
4蛋白酶抑制可在体外和体内防止B.vulgatus诱导的结肠上皮损伤
肠道单层的共聚焦显微镜显示B.vulgatus处理的上皮细胞有显著影响，紧密连接蛋白、Zo-1和Occludin有明显改变（图5d和补充图5）。成像研究还证明了对用B.vulgatus处理的Caco-2细胞的细胞形态和肌动蛋白网络的潜在影响（补充图5）。对单层细胞形状的分析显示出显着的细胞圆形度的降低（P=0.0043），这可以通过蛋白酶抑制来恢复（图5e）。
为了研究B.vulgatus蛋白酶在体内的作用，我们在IL10/无菌小鼠模型中用B.vulgatus进行了单菌定殖，将一般老鼠的饮用水用我们选择的蛋白酶抑制剂混合物补充（图5f）。定殖10周后蛋白酶抑制对结肠上皮细胞具有保护作用，减少隐窝的炎症细胞浸润（图5g）。蛋白酶抑制剂治疗显着改善了组织学结肠炎的严重程度（调整P值=0.0061，图5h)，伴随着B.vulgatus引起的隐窝增生显着减少（调整P值=0.0028，图5i）。宏观特征，例如小鼠的结肠长度，没有显着差异（补充图6a-h）。进一步，肠系膜淋巴结的免疫细胞谱显示CD4+、Th1、Th17和Treg细胞群之间没有显着差异（补充图6i-l和图7）。在这项研究中，我们无法评估蛋白酶处理在多大程度上反映了与非蛋白水解拟杆菌定殖的小鼠相似的状态，因为该对照组不包括在内。
5UC患者粪便中存在的B.vulgatus蛋白酶在移植到无菌小鼠后会导致结肠炎的严重程度
接下来我们评估在UC患者中高水平的B.vulgatus蛋白酶对肠道炎症发展的影响程。为此，我们将UC患者的粪便移植到易患结肠炎的IL10缺陷的无菌小鼠中（图5j）。我们选择了2组是否含有高水平B.vulgatus蛋白酶的患者粪便样本（每组3名UC患者），用于移植到易患结肠炎IL10缺陷的无菌小鼠中。这些小鼠中有一半通过饮用水给予蛋白酶抑制剂混合物（每种组9只小鼠）。根据疾病的两个总体指标（结肠缩短和脾肿大情况，图5k,l）和组织病理学分析（图5m），给予富含蛋白酶的粪便样本的小鼠表现出明显的结肠炎。这些表型在接受缺乏大量B.vulgatus蛋白酶的UC患者粪便的小鼠中并不明显。在其他器官上未观察到显着差异（扩展数据图9a-f）。蛋白酶抑制剂混合物在给予低蛋白酶粪便样本的小鼠中这些参数没有显著影响，但显著减轻了接受富含蛋白酶的粪便样本的小鼠表现出的结肠炎。通过测量粪便载脂蛋白丰度和脾脏细菌负荷来评估结肠炎症显示出相似的程度，但未达到统计学意义（扩展数据图9g，h）。这些研究表明，拟杆菌属蛋白酶增加的UC患者的微生物群具有较高的致结肠潜在性，并表明蛋白酶抑制可作为严重UC的治疗干预方式。
讨论
此研究中我们有效地收集IBD患者的广泛的多组学特征并将其转化为具有生物学和治疗价值的猜想。除了体外和体内验证外，通过整合粪便宏蛋白质组学、代谢组学、16S基因扩增子测序、鸟枪宏基因组测序、宏肽组学和血清蛋白质组学，我们证明了微生物组的某些成员，例如B.vulgatus，可能通过蛋白酶活性促进UC疾病恶化。此外，基于我们的体外和体内的实验结果显示拟杆菌属蛋白酶抑制剂可作为UC的潜在治疗方法。
虽然细胞外基质重塑和蛋白酶活性变化是IBD中已知的事件，但细菌蛋白酶在IBD中的作用主要是靠推测。该领域的工作主要集中在宿主蛋白酶上，例如在IBD患者中减少的胰蛋白酶，或可降解常用的治疗药物的基质金属蛋白酶。一些作者估计，UC患者中约27%的蛋白水解来自细菌蛋白酶。当小鼠使用抗生素降低了微生物组衍生的丝氨酸蛋白酶的活性时，进一步证明了细菌蛋白酶活性在胃肠道中的重要性。这里我们能够直接识别可能导致IBD的细菌蛋白酶的种类和特性。鉴于目前对UC的治疗主要针对宿主炎症通路，我们的研究结果代表了治疗的另一种方法。有趣的是，与最有希望的细菌蛋白酶类似的人体DPPIV酶已经被认为是治疗开发的潜在目标。据我们估计，约40%的UC患者（可能受益于细菌蛋白酶抑制的大部分患者）可能过度表达B.vulgatus丝氨酸蛋白酶。
我们的研究中存在几个局限性。一个限制是我们在实验中使用了非特异性蛋白酶抑制剂，因此无法区分对我们的表型最重要的特定蛋白酶或蛋白酶类。其次，我们的单独移殖菌群研究不包括额外的对照组来比较蛋白酶抑制治疗后反映健康表型的程度。最后，我们在结肠上皮屏障上使用B.vulgatus上清液的实验并没有破坏在共培养中的膜完整性，强调需要更多的工作来确定我们观察到的表型的条件和机制。
这里显示的多维度多组学整合不仅是未来IBD多组学研究的重要资源，而且还作为一个例子展示了利用多组学数据整合进行验证猜想的发展。从对数百名IBD患者的广泛分析开始，并根据感兴趣的观察进一步完善我们的分析，从而在每个数据库为我们的假设提供了综合证据。我们通过大量体外和体内研究进一步缩小并验证了我们的主要假设，这些研究证明了蛋白酶功能抑制对预防B.vulgatus诱导的结肠炎的功效。总的来说，我们的研究突出了研究拟杆菌蛋白水解作用的重要性，并证明了来自B.vulgatus的蛋白水解功能可能与UC病理学和治疗有关。
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