各类肠癌细胞由本实验室保存,DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、Lipofectamine2000转染试剂等均购自Gibco公司;兔抗人FOXG1抗体购自Abcam公司;兔抗人E-cadherin、Vimentin、鼠抗人Fibronectin抗体购自CellSignaling公司;分子克隆和慢病毒包装等试剂由本实验室保存;Trizol试剂购自Invitrogen公司;逆转录聚合酶链式反应试剂盒购自TaKaRa公司;所有引物均由金斯瑞公司负责合成。
人结肠癌细胞系RKO、SW480、SW620、LOVO、DLD-1培养于含10%胎牛血清1640培养基中(含青链霉素)在37℃、5%CO2的培养箱中孵育,当细胞密度达80%左右进行传代,本实验采用对数生长期中的细胞进行实验。
提取总蛋白,制10%胶进行SDS-PAGE,转膜2h,5%脱脂牛奶封闭1h,一抗孵育4℃过夜,一抗比例:GAPDH(1:1000)、FOXG1(1:700)、E-cadherin(1:1000)、Vimentin(1:1000)Fibronectin(1:1000),PBST洗1h每10min换一次液,二抗室温孵育1.5h,PBST再洗1h,拍照存图。
设计并合成3对FOXG1的shRNA片段(shFOXG1),运用DNA重组技术获得重组质粒,经双酶切技术及测序方法鉴定正确后进行慢病毒的包装,包装后存放于-80℃,细胞分为加入病毒的PLKO.1-shFOXG1实验组及未经处理的阴性对照组。转染前将细胞接种于6孔板中,当细胞密度达50%左右进行细胞稳定转染,转染前1h常规换液,经嘌呤霉素筛选约1个月后可获得稳定的细胞株。
将细胞接种于6孔板中,待细胞融合率达到70%80%时,使用枪头比着直尺用力划线,用PBS轻轻冲洗划下的细胞,加无血清培养基继续培养,分别在0h和48h拍照存图。
计量资料用x+s表示,采用SPSS13.0进行两独立样本的t检验,P≤0.05有统计学意义。
综上所述,本研究证明FOXG1能促进结直肠癌细胞侵袭和转移,并促进其发生EMT,有望成为一个新的治疗靶点,但其具体机制还需进一步探究。