本发明具体涉及一种降血糖功效的植物乳杆菌及其筛选方法和应用药剂。
背景技术：
国际糖尿病联盟公布了第八版的全球糖尿病地图。结果显示，全球糖尿病成人患者(20-79岁)从2000年的1.51亿，到2017年已达到4.25亿，增加近2倍。预计到2045年，糖尿病患者可能达到6.29亿。而中国的糖尿病患者位居世界第一，糖尿病被公认为世界第三大致死性疾病，其发病率呈逐年增加趋势，且ⅱ型糖尿病患者的比例高达90％以上。目前主要通过药物降低血糖来达到治疗ⅱ型糖尿病的目的。针对糖尿病的降糖药物通常会引起一系列的不良反应，如腹泻、耐药性和继发性失效等问题。近年来由于乳酸菌的天然性和安全性，逐渐成为糖尿病防治的研究热点。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题之一是体外降糖乳酸菌的筛选方法的建立；本发明要解决的技术问题之二是提供应用上述筛选方法得到的一株经过体内验证得降糖菌株lactobacillusplantarumct152，它在体外模拟的胃肠液和胆盐环境下具有较高的存活率；且具有一定的抗氧化和抗糖尿病的特性；本发明要解决的技术问题之二是提供一种应用到该降糖菌株lactobacillusplantarumct152的降血糖药剂。
为达到上述要求，本发明采取的技术方案是：提供一种植物乳杆菌，该植物乳杆菌的保藏编号为cctccno:m2019591，拉丁文名称为lactobacillusplantarumct152，保藏地为中国典型培养物保藏中心，保藏地地址为湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学校内，保藏日期为2019年7月30日；提供一种具有降血糖功能的药剂，采用上述的植物乳杆菌；提供一种植物乳杆菌的筛选方法，包括如下步骤：
s1：进行益生指标测定，包括模拟的胃肠液中的存活率测定、胆盐耐受力测定、对caco-2细胞的粘附能力测定及抗生素耐药性检测；
s2：进行抗氧化能力测定，包括乳酸菌清除dpph能力的测定、乳酸菌清除羟自由基能力测定、乳酸菌抗脂质过氧化能力测定、乳酸菌的还原能力测定及乳酸菌的gsh-px和t-sod的酶活测定；
s3：进行乳酸菌的抗糖尿病特性的检测，包括大鼠肠道α-glucosidase活力抑制率的测定和乳酸菌干预高糖刺激胰岛细胞分泌胰岛素实验；以及
s4：进行体内实验的验证，包括2型糖尿病模型大鼠的构建及进行灌胃治疗。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，在这些附图中使用相同的参考标号来表示相同或相似的部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1示意性地示出了根据本申请一个实施例的植物乳杆菌对ins-1细胞胰岛素分泌量的影响的示意图。
图2示意性地示出了根据本申请一个实施例的植物乳杆菌对caco-2细胞的粘附率示意图。
图3示意性地示出了根据本申请一个实施例灌胃四周大鼠随机血糖变化值的示意图。
图4示意性地示出了根据本申请一个实施例中灌胃六周大鼠随机血糖变化值。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图及具体实施例，对本申请作进一步地详细说明。
在以下描述中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”、“示例”等等的引用表明如此描述的实施例或示例可以包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度，但并非每个实施例或示例都必然包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度。另外，重复使用短语“根据本申请的一个实施例”虽然有可能是指代相同实施例，但并非必然指代相同的实施例。
为简单起见，以下描述中省略了本领域技术人员公知的某些技术特征。
根据本申请的一个实施例，提供一种植物乳杆菌，该植物乳杆菌的保藏编号为cctccm2019591，拉丁文名称为lactobacillusplantarumct152；并提供一种一种具有降血糖功能的药剂，该药剂采用权利要求1所述的植物乳杆菌。
根据本申请的一个实施例，提供一种植物乳杆菌的筛选方法，该植物乳杆菌的筛选方法具体包括如下步骤：
(1)益生指标测定：
1)模拟的胃肠液中的存活率：将乳酸菌用0.85％生理盐水重悬后，在模拟胃液(ph3.0)中将其菌液密度调节为1×109cfu/ml。混匀后将其放置于37℃培养1，2和3h后分别计活菌数。在模拟胃液中培养3h后，取1ml培养液加入至9ml模拟肠液(ph8.0)中，混匀后于37℃培养。分别于2、4和8h检测活菌数。用mrs固体培养基37℃培养48h，计算其存活率。
存活率(％)＝[logcfun1/logcfun]×100％；
n1＝经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数，n0＝未处理前乳酸菌的活菌数。
3)对caco-2细胞的粘附能力：caco-2细胞生长在含有20％胎牛血清，1％l-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸和1％双抗的高糖dmem培养液中，37℃，5％co2的培养箱中进行培养，隔天更换一次培养液，等细胞增殖融合率达80％左右时，以含0.02％edta的0.25％胰酶消化细胞，按1:2-1:3传代。取对数生长期细胞进行试验。
将新鲜培养的乳酸菌用pbs洗两次，调节细菌浓度为1×109cfu/ml，悬浮于100mg/ml异硫氰酸荧光素(fifc)中，37℃暗处作用0.5-1h，用pbs洗涤4次去除未结合的fifc。将caco-2细胞以4×105-5×105cell/孔接种于6孔板，37℃培养16-24h。将fifc标记的乳酸菌重悬于dmem培养基中，调整其密度为1×109cfu/ml。将此菌悬液加入到caco-2细胞单层中，37℃作用1-2h，用无菌pbs洗涤3次，将未粘附的菌洗脱掉，之后每个培养的孔中加入胰酶作用，待细胞完全脱落，加入0.4ml完全培养基终止反应。收集液体，用多功能酶标仪测定其荧光强度来计算其细菌的黏附率。a和a0分别表示乳酸菌粘附细胞前后的荧光强度。
粘附率(％)＝loga/loga0×100％。
4)抗生素耐药性检测：
mic测定采用微量肉汤稀释法。分别将常用的抗生素配制成相应的贮存液，mrs液体培养基2倍梯度稀释成使用液。向无菌的96孔板中加入198μl含不同浓度抗生素的mrs液体培养基后，接种2μl菌株的培养液(约1.0×107cfu/ml)，37℃静止培养24h后，统计不同菌株的mic。每组重复3次，并设置对照组。
(2)抗氧化能力测定：
1)乳酸菌清除dpph能力的测定：反应体系中加入1ml乳酸菌的菌悬液，无细胞提取物或者发酵上清液，再加入1ml0.2mmol/ldpph的无水乙醇，震荡充分混匀，在室温下避光反应30min，再于6000rpm离心10min，取其上清，517nm波长处测定样品吸光度(od值)。用等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并以等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照以下公式计算：
dpph自由基的清除率＝[1-a517(样品)/a517(对照)]×100％
2)乳酸菌清除羟自由基能力测定：根据南京建成生物公司的羟自由基试剂盒测定，不做按照其说明书严格执行。
3)乳酸菌抗脂质过氧化能力测定：0.5mlph7.4的pbs中加入1ml亚油酸乳化液，加入0.2ml0.01％的硫酸亚铁和0.01％的抗坏血酸，再加入0.2m-0.5ml发酵上清，菌悬液或者细胞提取物，混匀后放置于37℃水浴中反应12h，取2ml反应液加入0.2ml0.4％的三氯乙酸，2ml0.8％的硫代巴比妥酸和0.2ml0.4％bht，震荡充分混匀后，在100℃下反应30min，直至样品冷却后再加入2ml三氯甲烷进行抽提，离心10min后，收集上清。532nm波长下测定样品od值，以pbs作为空白对照。按照下式计算乳酸菌抗脂质过氧化的能力：抗脂质过氧化率＝[1-a532(样品)/a532(空白)]×100％。
4)乳酸菌的还原能力测定：0.5ml菌悬液或细胞提取物中加入1％铁氰化钾0.5ml，0.5mlpbs(ph6.6)，震荡充分混匀，于50℃中水浴20min，样品替换为蒸馏水后可作为对照组。在冰浴中急速冷却后，加入0.5ml10％的三氯乙酸，3000rpm离心10min，取其1ml上清后加入1ml0.1％的fecl3，反应10min后在700nm波长下测定样品的od值。结果采用半胱氨酸作为标准表征还原力，计算公式如下：还原能力＝[a700(样品)-a700(对照)/a700(对照)]×100％。
5)乳酸菌的gsh-px和t-sod的酶活测定：
用南京建成的试剂盒检测乳酸菌发酵上清和细胞提取物中gsh-px和t-sod的酶活，具体操作严格按照试剂盒说明书。
(3)乳酸菌的抗糖尿病特性
1)大鼠肠道α-glucosidase活力抑制率的测定
在150μlpbs(0.1mph6.8)中加入75μl20mm的pnpg溶液及25μl，待测乳酸菌的发酵上清，无细胞提取物和完整细胞，将混合物于37℃水浴10min。加入50μl大鼠肠道提取的α-glucosidase溶液(0.17u/ml)继续反应10min。加入1ml0.1mna2co3作为反应终止液。并将反应液于405nm处测其吸光值，吸光值与对硝基酚(pnp
)的游离量成正比。反应体系中采用ph6.8的0.1mpbs作为α-glucosidase溶液及待测样品的空白对照，采用以下公式计算样品的抑制活性。
酶抑制率(％)＝[1-(c-d)/(a-b)]×100％
其中：a为含有α-glucosidase溶液但不含样品的测定吸光
b为不含α-glucosidase溶液及待测样品的测定吸光值
c为含有α-glucosidase溶液及待测样品的测定吸光值
d为不含α-glucosidase溶液但含待测样品的测定吸光值
2)乳酸菌干预高糖刺激胰岛细胞分泌胰岛素实验
乳酸菌在mrs液体培养基中厌氧传代2次，每次37℃下孵育18h，使菌株活力达到最高值。对菌悬液以灭菌的pbs缓冲液进行梯度稀释，采用平板倾注法，在mrs固体培养基上37℃培养24-48h，测定活菌数(保证每个平板30-300的活菌菌落)。根据菌粉活菌数，配制1×109cfu/ml的菌悬液，经过120kw超声破碎，然后65℃、30-60min灭活处理，8000×g离心获得菌体混合物沉淀。用不含双抗的ins-1细胞培养液进行重悬，作为gsis实验刺激细胞的培养液，储存于4℃待用.
ins-1细胞以4×105-5×105cells/ml的密度接种于6孔板，孵育过夜待细胞贴壁，然后换用含有灭活菌液的细胞培养液孵育16-24h，对细胞进行不同益生菌株的干预作用。各组细胞处理结束后，细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次，加入葡萄糖浓度16.7mmol/l的高糖ins-1完全培养液，37℃下孵育0.5-1h。然后收集细胞上清液，用elisa法检测各组在高葡萄糖刺激下的胰岛素的分泌量。elisa检测步骤按照试剂盒说明书进行，吸光度采用酶标仪(450nm处)进行检测。以od值为纵坐标(y)，标准物浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，并根据此计算其他样品的浓度。
(4)体内实验的验证
1)2型糖尿病模型大鼠的构建
第五周，所有大鼠禁食不禁水12-18h，除低脂组外，其余各组大鼠均按照30-40mg/kg体重注射新鲜配制的链脲霉素stz。将一定量stz溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(ph4.5)，现配现用，冰浴保存，低脂组注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(ph4.5)。造模后72h期间保证充足的无菌水及高脂饮食，并每日更换垫料，72h后随机血糖高于16.7mmol/l或者空腹血糖高于11.7mmol/l的为造模成功的糖尿病大鼠。
2)灌胃治疗
将成模大鼠随机分为模型组、lgg组、ct152组，模型组用0.85％的生理盐水作为对照，lgg和cctccm2019591以1×109cfu/day进行为期6-8周的灌胃治疗。
体内实验的验证中灌胃6周大鼠随机血糖变化值如图4所示。
乳酸菌菌剂的制备：1)将cctccm2019591菌株接种于固体斜面培养基上，在37℃培养16-24h进行活化，然后取培养好的固体斜面培养基，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，在37℃培养16-24h，制得一级种子液；按照2-5％的接种量，将一级种子液接种于种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养16-24h，然后收集发酵液。2)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2-3遍后，按照菌：保护剂为1:1-1:2(保护剂可为常用的海藻糖、脱脂乳粉、山梨醇、甘露醇等或其为原料的复配保护剂)比例混合后进行冷冻干燥，粉碎，即成为乳酸菌菌剂。
本发明提供一种广泛系统地降糖乳酸菌的筛选方法，且用此方法筛选得到一株具有益生、高氧化活性和潜在降糖功效的植物乳杆菌，该菌株分离筛选自传统发酵食品泡菜中，命名为lactobacillusplantarumct152,保藏编号为cctccm2019591，保藏日期为2019年7月30日，保藏于中国武汉市中国典型培养物保藏中心。
该菌株在mrs培养基上，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色，菌落大小均匀。生理特性：能利用n-乙酰基-d半乳糖胺，龙胆二糖，α-d-葡萄糖，d-纤维二糖，d-果糖，甘露糖，甘露醇，麦芽糖，β-甲基-d-葡萄糖，d-洛酮糖，d-核糖，水杨苷，d-海藻糖，d-木糖，丙酮酸甲酯，丙三醇，尿苷。不能利用淀粉，甘露聚糖，d-半乳糖，l-海藻糖，l-谷氨酸等等。
本发明从泡菜和发酵酸奶中分离纯化得到120株乳酸菌，通过耐酸和耐胆盐初筛得到18株候选的实验菌株，通过检测益生指标(模拟胃肠液的耐受能力、胆盐耐受能力、对caco-2细胞的粘附能力)；抗氧化性指标(对dpph自由基的清除能力、羟自由基的清除能力、抗脂质过氧化能力、还原能力，以及对谷胱甘肽过氧化物酶gsh-px和总超氧化物歧化酶t-sod活力的测定)；抗糖尿病指标(α-葡萄糖苷酶抑制率的测定和在乳酸菌干预下大鼠胰岛瘤细胞ins-1产胰岛素能力测定)来综合评价候选20株乳酸菌的降血糖能力，通过主成分分析法(pca)分析得到益生、抗氧化、抗糖尿病的指数得分情况，再运用层次分析法(ahp)得到降糖综合指标得分，以商业菌株lgg(lactobacillus.rhamnosusggatcc53103)为对照，得到较lgg综合得分较高者为筛选出来的降糖菌株。
本发明所采用的培养基配方(1l)：蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸氢铵2g，乙酸钠5g，七水硫酸镁0.5g，五水硫酸锰0.25g,吐温801ml，琼脂20g(固体培养)，碳酸钙7.5g(固体分离培养)。
本实施例的各项测试记录如下表1-表8所示，其中：
表1为乳酸菌对肠胃液的耐受能力测定；
表2为乳酸菌对胆盐耐受能力测定；
表3乳酸菌dpph清除和羟自由基清除能力；
表4乳酸菌抗脂质过氧化和还原能力测定；
表5乳酸菌发酵上清和细胞内gsh-px和t-sod的活力；
表6乳酸菌对大鼠肠道提取的α-glucosidase活力的抑制率；
表7乳酸菌抗生素敏感性测试结果；
表8通过pca和ahp方法综合降糖指数得分情况；
表1：
表2：
表3：
表4：
表5：
表6：
表7：
gen,庆大霉素；amp,青霉素；km,卡拉霉素；str,链霉素；tet,四环素；
ery,红霉素；cli,克林霉素；van,万古霉素；rif,利福平；cm,氯霉素.
表8：
以上所述实施例仅表示本发明的若干实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明保护范围。因此本发明的保护范围应该以所述权利要求为准。